Summary
Het IP-FCM methode is gepresenteerd, die een gevoelige, robuust, biochemische evaluatie van de natieve eiwit-eiwit interacties mogelijk maakt, zonder dat genetische manipulatie of grote steekproeven.
Abstract
Immunoprecipitatie gedetecteerd door flowcytometrie (IP-FCM) is een efficiënte methode voor het detecteren en kwantificeren van eiwit-eiwit interacties. Het basisprincipe breidt dat van de sandwich ELISA, waarin de gevangen primaire analyt samen kunnen worden gedetecteerd met andere moleculen fysiek verbonden binnen multiprotein complexen. De procedure heeft betrekking op covalente koppeling van polystyreen latex microkorrels met immunoprecipitating monoklonale antilichamen (mAb) die specifiek zijn voor een eiwit van interesse, incuberen deze kralen met cellysaten, indringende gevangen eiwit-complexen met fluorochroom-geconjugeerde probes, en het analyseren van kraal-geassocieerde fluorescentie door flowcytometrie. IP-FCM is uiterst gevoelig, laat de analyse van eiwitten in hun eigen (niet-gedenatureerde) staat, en vatbaar is voor een semi-kwantitatieve of kwantitatieve analyse. Als extra voordelen, IP-FCM vereist geen genetische manipulatie of gespecialiseerde apparatuur, anders dan een flowcytometer, en het gemakkelijk kan worden aangepast voor high-throughput toepassingen.
Protocol
** Deze video protocol is gebaseerd op een bijbehorende publicatie 1: zeer gevoelig detectie en kwantitatieve analyse van natief eiwit-eiwit interacties en multiprotein complexen door flowcytometrie. Adam G. Schrum, Diana Gil, Elaine P. Dopfer, David L. Wiest, Laurence A. Turka, Wolfgang WA Schamel, Ed Palmer. Wetenschap STKE 2007 (389): pl2, 5 juni 2007, [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2]. Klik hier om deze publicatie te zien .
Voorafgaand aan Starten, verzocht de volgende Waterige Stock Solutions:
| MES Koppeling Buffer: | Bewaren bij 25 ° C |
| MES, pH 6,0 | 50 mM |
| EDTA | 1 mM |
| Afschrikken / blokkeren / Storage (QBS) Buffer: | Bewaren bij 4 ° C |
| BSA | 1% |
| Natriumazide | 0,02% |
| PBS, pH 7,4 | 1x |
| FCM Buffer: | Bewaren bij 4 ° C |
| Tris, pH 7,4 | 50 mM |
| NaCl | 100 mM |
| Natriumazide | 0,02% |
| FBS | 5% |
| PBS, pH 7,4 | 1x |
Voorafgaand onmiddellijk voor te bereiden op gebruik:
| EDAC-MES: | Los 50 mg / ml EDAC poeder in MES koppeling Buffer |
| Digitonine oplossing (2% w / v): | Los digitonine poeder in dH 2 O door verhitting tot 95 ° C voor 5min daarna afkoelen op ijs |
| Lysis Buffer: | |
| Tris, pH 7,4 | 50 mM |
| NaCl | 150 Mm |
| Digitonine oplossing | 1% |
| Proteaseremmers | 1x |
| Keep on ice |
1. Koppeling van mAb aan Beads
- Bepaal de concentratie van kralen uit de gekochte voorraad door het verdunnen in PBS en tellen met een hemacytometer. Begin met een verdunning van 1:10000 kralen voor het tellen.
- Pipetteer 18 x 10 6 kralen in een 1.5-mL microcentrifugebuis.
- Was de kralen 2 tot 3 keer in 0,5 tot 1,0 ml MES koppeling Buffer, centrifugeren bij 20.000 g gedurende 3 minuten bij 25 ° C na elke wasbeurt.
- Resuspendeer de kralen in 50 uL MES Koppeling Buffer.
- Activeer de carboxylgroepen op de kralen door de toevoeging van 20 ul van vers bereide EDAC-MES.
- Mix zachtjes gedurende 15 min bij 25 ° C door met de hand en neer te pipetteren.
- Was de geactiveerde kralen 2 tot 3 keer in 0,5 tot 1,0 ml PBS, centrifugeren bij 20.000 g gedurende 3 minuten bij 25 ° C na elke wasbeurt.
- Resuspendeer de geactiveerde kralen in 50 ul PBS.
- Voeg 50 ul van de IP-mAb (bij 0,2-1,0 mg / ml voorraad concentratie) aan de geactiveerde kraal oplossing.
- Mix voor 3 tot 4 uur bij 25 ° C door het plaatsen van de buis op een trillend shaker. Schud voldoende om te voorkomen dat de afwikkeling van de kralen op de bodem van de buis.
- Was mAb-gekoppelde beads 2 tot 3 keer in 0,5 tot 1,0 ml PBS, centrifugeren bij 20.000 g gedurende 3 minuten bij 25 ° C na elke wasbeurt.
- Resuspendeer de kralen in 100 ul QBS Buffer. Deze kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C.
- Opschorting van de beads goed, verdunnen 1:200-1:10,000 in PBS en tellen met een hemacytometer. De concentratie moet worden gemeten voor elke voorbereidende partij, zodat het aantal kralen die in elk IP-of pull-down experiment kan nauwkeurig worden geregeld.
2. Post-nucleaire Lysate Voorbereiding en Ip
De lysis methode en optimale lysis voorwaarden hangt af van het celtype en de eiwit-eiwit interacties onderzocht. Een aantal protocollen bestaan en kan worden aangepast voor uw toepassing.
- Lyse 20 x 10 6 'kleine' cellen, zoals lymfocyten, of 5 x 10 6 'grote' cellen, zoals macrofagen of tumorcellen, in 100 ui verse Lysis buffer in een 1.5-mL microcentrifugebuis voor 20min op het ijs. Schaal van de lysis volume als dat nodig is.
- Voor het verwijderen van kernen en onoplosbare cellulaire puin, centrifuge het lysaat op 20.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Houd het supernatant af en gooi de pellet.
- Voeg 0,5 x 10 5 tot 2,5 x 10 5 mAb-gekoppeld kralen aan de geklaarde lysaat, pipetteren voorzichtig te mengen. Het minimale volume die we gebruiken omhet uitvoeren van een enkele IP is 5 microliter.
- Leg ze op een verticale draaiende wiel 4 uur tot 's nachts in een koude kamer. Ingesteld om voldoende snelheid om de kralen te voorkomen dat de afwikkeling. Het is aanvaardbaar voor de vloeistof van laag-volume IP's in de bodem van de buis te blijven tijdens het draaien.
3. Aftasten van Bead-gevangen eiwit met fluorochroom-geconjugeerde antilichamen
- Was de IP-kralen twee keer bij 0,2 tot 1,0 ml ijskoude FCM Buffer, centrifugeren bij 20.000 g bij 4 ° C gedurende 3 minuten na elke wasbeurt.
- Resuspendeer de kralen in 100 ul FCM Buffer en aliquot 20 pi in elk van de vijf of meer 1.5-mL microcentrifugebuizen of putten van een schoorsteen-bodemplaat.
- Voeg fluorochroom-geconjugeerd mAbs om de monsters. Voer de FCM vlek volgens de leverancier de instructies of volgens het empirisch bepaalde concentraties. Als uitgangspunt, voeg 0,2 tot 1 ul van aandelen antilichaam-oplossing (bij 0.2-1.0 mg / ml) per tube of goed, en incubeer gedurende 40 minuten op het ijs.
- Was peilden kralen in 1,5 ml buisjes twee keer in 1,0 ml ijskoude FCM Buffer, centrifugeren bij 20.000 g bij 4 ° C gedurende 3 minuten na elke wasbeurt. Verwijder voorzichtig het supernatant na elke wasbeurt, zorg ervoor dat u de kralen verstoren. Voor een schoorsteen-bodemplaat, was twee keer met 0,2 ml ijskoude FCM Buffer, centrifugeren bij 1000g gedurende 5 min bij 4 ° C na elke wasbeurt. Een multichannel pipet is handig voor deze stap. Om supernatant uit kralen in een schoorsteen-bodemplaat, 'flick' de plaat een keer, toen, terwijl nog upside-down, blot alle druppels van de randen van de putten. De resterende volume in elk putje, met de kralen, zal ongeveer 20 pi worden.
- Resuspendeer de kralen in 200 pi FCM Buffer per monster. Transfer naar het label FACS buizen. Monsters zijn nu klaar voor FCM.
4. FCM Acquisitie
De CML kralen beschreven in dit protocol zijn 3 tot 5 micrometer in diameter, ongeveer de helft van de diameter van een slapende muis lymfocyt. Daarom kan het nodig zijn om handmatig te verhogen Forward Scatter (FSC) versterker te krijgen en de Side Scatter (SSC) spanning, om voor de bevolking van de kraal gebeurtenissen te registreren op schaal. Individuele IP kralen moeten vormen een strak geclusterde bevolking. De instellingen en de gate moet worden aangepast tot hiel wambuizen en puin uit te sluiten.
- Voorafgaand aan de lopende kralen of kralen normen, verwijder dan de druppel insluiting huls dat de steekproef inlaat rond op sommige cytometers. Laat de schede vloeistof te druppelen tussen de samples, omdat dit de inlaat te wissen en te voorkomen dat kralen van worden overgeboekt van het ene monster naar het andere.
- Gebruik ongelabelde kralen, een negatieve controle van de fluorescentie, en Rainbow Kalibratie Particles (RCPs), een positieve controle van fluorescentie, om de instellingen aan te passen, zodat zowel de negatieve en positieve fluorescentie uitersten tegelijkertijd op de log-schaal van de x-as. Dit zorgt ervoor dat de fluorescentie van de experimentele monsters ook zal zijn op schaal. Merk op dat RCPs kleiner zijn dan de CML kralen, zodat FSC en SSC parameters, evenals gate positie, kan het nodig zijn om tijdelijk worden aangepast voor dat monster.
- Keer terug naar ongelabelde-bead instellingen een keer kalibratie met RCPs is voltooid. Als er slechts een fluorescente probe per monster wordt gebruikt, geen fluorescentie compensatie nodig is. In het algemeen, we probe multiprotein complexen met een fluorochroom-geconjugeerd mAb per FCM monster, en we meerdere interactie partners onderzoeken door kleuring parallel kraal monsters met mAbs specifiek voor de verschillende subeenheden.
- Verwerven en op te slaan fluorescentie gegevensbestanden. Analyse kan dan worden uitgevoerd met behulp van flowcytometrie software zoals CellQuest, FlowJo of cflow.
5. Representatieve resultaten
Figuur 1. IP-FCM voor TCR/CD3 multiprotein complex. T-cellen van de muis stam BALB / c werden gelyseerd in 1% digitonine, en het lysaat werd onderworpen aan IP-FCM met behulp van anti-CD3ε kralen. De gevangen complexen die grote hoeveelheden van TCR-β (paars regio) en co-geassocieerde CD3-ε (groen), maar dicht bij achtergrond niveaus (gedefinieerd door de irrelevante immunoglobuline sonde, roze spoor) van andere eiwitten zoals Thy1.2, CD45, of H-2K (d) (bruin, oranje en blauw sporen, respectievelijk). Zie soortgelijke eerder gepubliceerde resultaten 1-6.
Discussion
Informatie over eiwit-eiwit interacties is zeer relevant voor de analyse van een groot aantal cellulaire processen zoals signaaltransductie, geslacht rijping, cel-cyclus progressie, en apoptose watervallen. IP-FCM biedt een snelle, kwantitatieve, en gevoelige manier om de interactie van eiwitten te onderzoeken en bepalen de leden van multiprotein complexen in hun natieve conformatie. Kralen kunnen worden gekoppeld en geïncubeerd met cellysaten in een dag en kan worden gepeild en geanalyseerd de volgende dag. Een 96-well plaat formaat zorgt voor grote aantallen monsters te analyseren in een keer om een efficiënte verzameling van gegevens voor statistische of screening doeleinden. Met behulp van fluorescerende kraal normen, kan het aantal eiwitten gevangen genomen door elke kraal worden geschat. Zeer weinig bronmateriaal nodig is voor het vastleggen en detectie, zo beperkt samples en schaarse analyten mogen alleen nog worden geanalyseerd voor meerdere interacties. Hoewel de IP-FCM vereist geen genetische manipulatie, epitoop-tagging, denaturatie, of in-vitro mengen van eiwitten in een niet-fysiologische omgeving, kan het gepaard gaan met deze en andere technieken, waardoor het een waardevol en toegankelijk hulpmiddel bij toepasselijkheid op vele biologische systemen.
Problemen oplossen:
Veel IP-FCM experimenten genereren bruikbaar proteïne interactie data van de eerste keer dat ze worden geprobeerd. Echter, het optimaliseren van IP-FCM kan antilichaam conjugatie te verbeteren kralen, eiwitcomplex te vangen, en fluorescerende probe bindend.
De efficiëntie van IP-antilichaam conjugatie kan worden bepaald door sonderen gekoppeld kralen direct met een anti-immunoglobuline antilichaam. Als dit rendement laag is, kan het verhogen van de concentratie van antilichaam tijdens de koppelingsreactie kunnen meer IP-antistoffen te hechten aan elke kraal. Dit kan de bindingscapaciteit van de IP-kraal partij, wat resulteert in verbeterde vangen en opsporen van analyten. Andere primaire-amine bevattende moleculen (bijv. Tris, bovine serum albumine) mag niet aanwezig zijn tijdens de koppeling reactie, want deze kunnen met het mAb strijden om kraal hechting en resulteren in een lage mAb koppeling. Als vervoeging van mAb aan kralen blijkt problematisch om andere redenen, kunnen kralen in plaats daarvan worden gekoppeld aan avidine / streptavidine en gebiotinyleerde antilichamen kunnen vervolgens niet-covalent gebonden en gebruikt voor immunprecipitation.
Ondanks de goede antilichaam conjugatie, kunnen de eerste detectie van kraal-geassocieerde fluorescentie laag zijn. De eerste, complexe capture zelf kan te laag zijn. Omdat de IP-FCM afhankelijk van de concentratie van analyten, het verhogen van het aantal cellen gelyseerd per eenheid lysis volume kan toenemen analyt vangen en detectie. Bovendien is het mogelijk vast te leggen worden vergroot door het verminderen van het aantal IP-kralen geïncubeerd met het lysaat, die gevangen complexen over minder kralen, en resulteert in een toename van de gemiddelde fluorescentie per kraal wanneer gepeild verdeelt. Ten tweede, is het mogelijk dat de toegang van de sonde antilichaam aan de gevangen complexen sterisch gehinderd wordt door de immunoprecipitating antilichaam. In dit geval kan het probleem worden aangepakt door het gebruik van verschillende antilichamen en / of sonde vast te leggen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Eagles Innovation Award (Fraternal Orde van Eagles) en door de Mayo Foundation.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free) | Reagent | Interfacial Dynamics | 2-5000 | Store at 4°C. |
| Rainbow Calibration Particles | Reagent | Spherotech, Inc. | RCP-30-5A | Store at 4°C. |
| 2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES) | Reagent | Sigma-Aldrich | M-5287 | |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC) | Reagent | Sigma-Aldrich | 22980 E-6383 | Store at -20°C under desiccating conditions. |
| Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin | Reagent | Sigma-Aldrich | P-2714 | Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20°C. Handle with gloves. |
| PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney | Reagent | Fisher Scientific | 08-408-230 | For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining |
References
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).
- Schrum, A. G. Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).
- Teixeiro, E. T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains. Immunity. 21, 515-526 (2004).
- Teixeiro, E. Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development. Science. 323, 502-505 (2009).
- Treves, S. Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion. J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).
- Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes. J Exp Med. 201, 517-522 (2005).
