Summary
L'IP-FCM metodo viene presentato, che permette una sensibile, robusto, la valutazione biochimica di natale interazioni proteina-proteina, senza la necessità di ingegneria genetica o di campioni di grandi dimensioni.
Abstract
Immunoprecipitazione rilevata mediante citometria di flusso (IP-FCM) è un metodo efficace per il rilevamento e la quantificazione interazioni proteina-proteina. Il principio di base che si estende su panino ELISA, in cui l'analita catturato primario può essere rilevato insieme con altre molecole associate fisicamente all'interno di complessi multiproteici. La procedura prevede accoppiamento covalente di microsfere in lattice di polistirene con immunoprecipitating anticorpi monoclonali (mAb) specifico per una proteina di interesse, incubando queste perle con lisati di cellule, sondando complessi di proteine catturate con fluorocromo-coniugati sonde, e analizzando perline associati fluorescenza mediante citometria di flusso. IP-FCM è estremamente sensibile, permette l'analisi delle proteine nella loro nativa (non denaturato) dello stato, ed è suscettibile di entrambe le analisi semi-quantitativa o quantitativa. Come ulteriori vantaggi, IP-FCM non richiede manipolazione genetica o attrezzature speciali, che non sia un citofluorimetro, e può essere facilmente adattato per applicazioni ad elevato throughput.
Protocol
** Questo protocollo video si basa su una pubblicazione associata 1: ad alta sensibilità di rilevazione e analisi quantitativa dei nativi interazioni proteina-proteina e complessi multiproteici mediante citometria a flusso. Adam G. Schrum, Diana Gil, Elaine P. Dopfer, David L. Wiest, Laurence A. Turka, Wolfgang WA Schamel, Ed. Palmer. Scienza STKE 2007 (389): PL2, 5 giugno 2007, [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2]. Clicca qui per vedere questa pubblicazione .
Prima di partire, Preparare le seguenti soluzioni acquose archivi:
| MES Accoppiamento buffer: | Conservare a 25 ° C |
| MES, pH 6,0 | 50 mM |
| EDTA | 1 mM |
| Tempra / Blocco / Storage (QBS) Buffer: | Conservare a 4 ° C |
| BSA | 1% |
| Di sodio azide | 0,02% |
| PBS, pH 7,4 | 1x |
| FCM buffer: | Conservare a 4 ° C |
| Tris, pH 7,4 | 50 mM |
| NaCl | 100 mM |
| Di sodio azide | 0,02% |
| FBS | 5% |
| PBS, pH 7,4 | 1x |
Preparare immediatamente prima dell'uso:
| EDAC-MES: | Sciogliere 50 mg / ml polvere EDAC nel tampone MES accoppiamento |
| Digitonina soluzione (2% w / v): | Sciogliere in polvere digitonina dH 2 O da riscaldamento a 95 ° C per 5 minuti poi il raffreddamento su ghiaccio |
| Lysis buffer: | |
| Tris, pH 7,4 | 50 mM |
| NaCl | 150 Mm |
| Digitonina soluzione | 1% |
| Inibitori della proteasi | 1x |
| Tenere su ghiaccio |
1. Accoppiamento di mAb di Perle
- Determinare la concentrazione di perline dallo stock acquistato da diluire in PBS e contando con un emocitometro. Inizia con una diluizione 1:10000 di perline per il conteggio.
- Pipettare 18 x 10 6 perle in un 1,5 mL provetta.
- Lavare le perline 2 o 3 volte in 0,5-1,0 mL di tampone di accoppiamento MES, centrifugazione a 20.000 g per 3 minuti a 25 ° C dopo ogni lavaggio.
- Risospendere le sfere in 50 microlitri Buffer accoppiamento MES.
- Attivare i gruppi carbossilici sulla perle aggiungendo 20 l di preparati al momento EDAC-MES.
- Mescolare delicatamente per 15 minuti a 25 ° C manualmente pipettando su e giù.
- Lavare le perline attivate 2 o 3 volte in 0,5 a 1,0 ml di PBS, centrifugazione a 20.000 g per 3 minuti a 25 ° C dopo ogni lavaggio.
- Risospendere le sfere attivato in 50 microlitri di PBS.
- Aggiungere 50 microlitri della IP mAb (a 0,2-1,0 mg / ml concentrazione stock) alla soluzione attivata tallone.
- Mescolare per 3 o 4 ore a 25 ° C posizionando il tubo su una vibrante shaker. Agitare sufficiente per evitare sedimentazione delle perline sul fondo della provetta.
- Lavare mAb-perline accoppiate 2 o 3 volte in 0,5 a 1,0 ml di PBS, centrifugazione a 20.000 g per 3 minuti a 25 ° C dopo ogni lavaggio.
- Risospendere le sfere in 100 microlitri Buffer QBS. Questi possono essere conservato a 4 ° C.
- Sospendere le perline bene, diluire 1:200-1:10,000 in PBS e contare con un emocitometro. La concentrazione deve essere misurato per ciascun lotto preparativa, in modo che il numero di perline usato in ogni esperimento IP o pull-down può essere controllato con precisione.
2. Post-nucleare Preparazione del lisato e Ip
Il metodo di lisi e le condizioni di lisi ottimale dipenderà dal tipo di cellula e le interazioni proteina-proteina in esame. Un certo numero di protocolli esistenti e può essere modificato per l'applicazione.
- Lyse 20 x 10 6 'piccolo' cellule, come i linfociti, o 5 x 10 6 'grandi' le cellule, come i macrofagi o cellule tumorali, in 100 microlitri di buffer di lisi fresco in un 1,5 mL provetta per 20 minuti sul ghiaccio. Scala il volume lisi, se necessario.
- Per rimuovere i nuclei e insolubili detriti cellulari, centrifugare il lisato a 20.000 g per 10 minuti a 4 ° C. Tenere il supernatante e scartare il pellet.
- Aggiungere 0,5 x 10 5 a 2,5 x 10 5 mAb-perline accoppiate al lisato chiarificato, pipettare delicatamente per mescolare. Il volume minimo che usiamo pereseguire un singolo IP è di 5 microlitri.
- Mettere su una ruota in movimento verticale 4 ore per notte in una stanza fredda. Impostare a velocità sufficiente per evitare che le perle di assestamento. È accettabile che il liquido di basso volume IP di rimanere nel fondo della provetta durante la rotazione.
3. Probing di Bead-capture di proteine con Fluorocromo anticorpi coniugati
- Lavare le perline IP due volte in 0,2 a 1,0 ml ghiacciata buffer FCM, centrifugazione a 20.000 g a 4 ° C per 3 minuti dopo ogni lavaggio.
- Risospendere le sfere in 100 ul FCM tampone e aliquota 20 l in ciascuno dei cinque o più di 1,5 mL microprovette o pozzi di un camino con fondo piatto.
- Aggiungi coniugato a un fluorocromo anticorpi monoclonali ai campioni. Eseguire la FCM macchia secondo le istruzioni del fornitore o in base a concentrazioni empiricamente determinato. Come punto di partenza, aggiungere 0,2 a 1 microlitri di soluzione madre di anticorpi (a 0,2-1,0 mg / ml) al tubo o bene e incubare per 40 minuti sul ghiaccio.
- Lavare sondato perline in tubi da 1,5 ml due volte in 1,0 ml ghiacciata buffer FCM, centrifugazione a 20.000 g a 4 ° C per 3 minuti dopo ogni lavaggio. Rimuovere delicatamente il supernatante dopo ogni lavaggio, facendo attenzione a non disturbare le perline. Per un camino a fondo piatto, lavare due volte con 0,2 mL ghiacciata buffer FCM, centrifugazione a 1000g per 5 minuti a 4 ° C dopo ogni lavaggio. Una pipetta multicanale è utile per questo passo. Per rimuovere il surnatante da perle in un camino-piastra inferiore, 'sfogliare' il piatto una volta, poi, mentre ancora a testa in giù, ogni macchia gocciola dai bordi dei pozzi. Il volume residuo in ciascun pozzetto, contenente le perline, sarà di circa 20 l.
- Risospendere le sfere in 200 Buffer FCM microlitri per campione. Trasferimento a tubi etichettati FACS. I campioni sono ora pronti per FCM.
4. FCM Acquisizione
Le perle CML descritte in questo protocollo sono da 3 a 5 micron di diametro, circa la metà del diametro di un linfocita del mouse quiescente. Pertanto, può essere necessario aumentare manualmente il Forward Scatter (FSC) guadagno amplificatore e il Side Scatter (SSC) di tensione in modo che la popolazione di eventi tallone di registrare su scala. Individuale perline IP dovrebbero formare un unico popolo strettamente cluster. Le impostazioni e cancello deve essere regolato per escludere doppietti tallone e detriti.
- Prima di perline in esecuzione standard o tallone, rimuovere il manicotto di contenimento goccia che circonda l'ingresso del campionatore su alcuni citometri. Che il liquido guaina a gocciolare tra i campioni, in modo da cancellare l'ingresso ed impedire perline di essere riportati da un campione all'altro.
- Usa perle senza etichetta, un controllo negativo di fluorescenza, e particelle di calibrazione arcobaleno (RCPs), un controllo positivo di fluorescenza, per regolare le impostazioni in modo che entrambi gli estremi negativi e positivi fluorescenza appare contemporaneamente sul log-scala asse delle ascisse. Questo assicura che la fluorescenza da campioni sperimentali saranno inoltre on-scala. Si noti che RCPs sono più piccole rispetto alle perle CML, in modo da FSC e parametri SSC, nonché la posizione cancello, potrebbe essere necessario essere temporaneamente modificato per quel campione.
- Torna a senza etichetta-tallone impostazioni una volta di calibrazione con RCPs è completa. Se solo una sonda fluorescente per campione è usato, senza compensazione della fluorescenza è necessario. In generale, si sonda complessi multiproteici con un solo fluorocromo-coniugati mAb per campione FCM, e prendiamo in esame l'interazione partner più dalla colorazione parallelo campioni di cordone con anticorpi monoclonali specifici per le subunità diverse.
- Acquisire e salvare i file di dati di fluorescenza. L'analisi può essere effettuata utilizzando il software citometria a flusso come CellQuest, FlowJo, o CFlow.
5. Rappresentante Risultati
Figura 1. IP-FCM per TCR/CD3 complesso multiproteico. Cellule T dal ceppo di topi BALB / c sono state lisate in 1% digitonina, e il lisato è stato sottoposto a IP-FCM con anti-CD3ε perline. I complessi catturato conteneva quantità significative di TCR-β (regione viola) e co-associati CD3-ε (verde), ma vicino ai livelli di fondo (definito dalla sonda immunoglobuline irrilevante, rosa traccia) di altre proteine, come Thy1.2, CD45, o H-2K (d) (marrone, arancio, blu e tracce, rispettivamente). Vedi simili risultati precedentemente pubblicati 1-6.
Discussion
Informazioni sulle interazioni proteina-proteina è molto importante per l'analisi di molti processi cellulari come la trasduzione del segnale, la maturazione lignaggio, progressione del ciclo cellulare, apoptosi e cascate. IP-FCM fornisce un modo rapido, quantitativa e sensibile di esaminare l'interazione delle proteine e definiscono i membri di complessi multiproteici nella loro conformazione nativa. Sfere possono essere accoppiati e incubato con lisati cellulari in un giorno e possono essere esaminati e analizzati il giorno successivo. A 96 pozzetti formato piastra permette un gran numero di campioni da analizzare in una sola volta per fornire efficienti di raccolta dati a fini statistici o di screening. Utilizzando perline fluorescenti standard, il numero di proteine catturate da ogni perla può essere stimata. Molto materiale di origine poco è necessario per la cattura e il rilevamento, in modo da campioni limitati e scarsa analiti possono ancora essere analizzati per le interazioni multiple. Sebbene IP-FCM non richiede manipolazione genetica, epitopo-tagging, denaturazione, in vitro o miscelazione di proteine in modo non fisiologico ambiente, può essere accoppiato con queste e altre tecniche, che lo rende uno strumento valido e accessibile con applicabilità a molti sistemi biologici.
Risoluzione dei problemi:
Molti IP-FCM esperimenti di generare dati utili interazioni proteiche la prima volta che sono tentato. Tuttavia, l'ottimizzazione di IP-FCM può migliorare la coniugazione di anticorpi a perline, catturare le proteine complesse, e la sonda fluorescente vincolanti.
L'efficienza di coniugazione degli anticorpi IP può essere determinato dal sondaggio perline accoppiate direttamente con un anticorpo anti-immunoglobulina. Se questo rendimento è basso, aumentando la concentrazione di anticorpi durante la reazione di accoppiamento può permettere anticorpi più IP ad allegare ad ogni tallone. Questo può aumentare la capacità di legame del lotto IP tallone, con conseguente acquisizione maggiore e la rilevazione di analiti. Altre molecole contenenti ammine primarie (ad esempio tris, albumina di siero bovino) non deve essere presente durante la reazione di accoppiamento, in quanto questi possono competere con i mAb per il fissaggio tallone e risultato a basso accoppiamento mAb. Se coniugazione di mAb di perline si rivela problematica per altre ragioni, perline può invece essere accoppiato ad avidina / streptavidina, e gli anticorpi biotinilati può successivamente essere non un legame covalente e utilizzati per immunprecipitation.
Nonostante la coniugazione degli anticorpi buona, la rilevazione iniziale di perline associate fluorescenza può essere bassa. In primo luogo, la cattura complesso si può essere bassa. Poiché IP-FCM dipende dalla concentrazione di analiti, aumentando il numero di cellule lisate per unità di volume lisi può aumentare la cattura degli analiti e la rilevazione. Inoltre, l'acquisizione può essere migliorata riducendo il numero di perline IP incubati con il lisato, che distribuisce i complessi catturati attraverso un minor numero di perle, e si traduce in un aumento medio per fluorescenza tallone quando sondato. In secondo luogo, è possibile che l'accesso degli anticorpi sonda ai complessi catturato è stericamente ostacolato dalla anticorpi immunoprecipitating. In questo caso, il problema può essere affrontato utilizzando anticorpi diversi per catturare e / o sonda.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Premio Innovazione Eagles (Fraternal Order of Eagles) e dalla Fondazione Mayo.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free) | Reagent | Interfacial Dynamics | 2-5000 | Store at 4°C. |
| Rainbow Calibration Particles | Reagent | Spherotech, Inc. | RCP-30-5A | Store at 4°C. |
| 2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES) | Reagent | Sigma-Aldrich | M-5287 | |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC) | Reagent | Sigma-Aldrich | 22980 E-6383 | Store at -20°C under desiccating conditions. |
| Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin | Reagent | Sigma-Aldrich | P-2714 | Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20°C. Handle with gloves. |
| PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney | Reagent | Fisher Scientific | 08-408-230 | For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining |
References
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).
- Schrum, A. G. Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).
- Teixeiro, E. T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains. Immunity. 21, 515-526 (2004).
- Teixeiro, E. Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development. Science. 323, 502-505 (2009).
- Treves, S. Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion. J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).
- Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes. J Exp Med. 201, 517-522 (2005).
