Summary
Genetik mühendisliği ya da büyük örneklem büyüklüğü gerektirmeden, hassas bir doğal protein-protein etkileşimleri, sağlam, biyokimyasal değerlendirme sağlar IP-FCM yöntem sunulmuştur.
Abstract
Flow sitometri (IP-FCM) tarafından tespit Immunoprecipitation protein-protein etkileşimleri tespit edilmesi ve ölçülmesi için etkili bir yöntem. Temel ilke yakalanan birincil analit multiprotein kompleksleri içinde fiziksel olarak ilişkili diğer molekülleri ile birlikte tespit edilebilir neyin sandviç ELISA uzanır. Prosedürü, monoklonal antikorlar (mAb) belirli bir protein ilgi immunoprecipitating hücre lizatları bu boncuklar kuluçka florokrom-konjuge problar ile yakalanan protein kompleksleri sondalama ve boncuk ilişkili floresan flow sitometri analiz ile polistiren lateks mikro kovalent kaplin içerir. IP-FCM, son derece duyarlı, kendi ana (denatüre) devlet proteinlerin analizi sağlar ve iki yarı-kantitatif veya kantitatif analiz için uygun. IP-FCM ek avantajlar olarak, bir akış sitometresinde dışında hiçbir genetik mühendisliği ya da özel ekipman gerektirir ve yüksek hacimli uygulamalar için kolayca adapte edilebilir.
Protocol
Yerli protein-protein etkileşimleri ve akış sitometri multiprotein kompleksleri Yüksek hassasiyet algılama ve kantitatif analiz: ** Bu video protokolü ilişkili bir yayın 1 dayanmaktadır. Adam G. Schrum, Diana Gil, Elaine P. Dopfer, David L. Wiest, Laurence A. Turka, Wolfgang WA Schamel Ed Palmer. Bilim STKE 2007 (389): PL2 5 Haziran, 2007, [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2] Bu yayının görmek için buraya tıklayınız .
Başlamadan Önce, ardından Sulu Stok Çözümleri hazırlayın:
| MES Kaplin Tampon: | Mağaza 25 ° C |
| MES, pH 6.0 | 50 mM |
| EDTA | 1 mM |
| Su Verme / / Depolama (QBS) Tampon Engelleme: | Mağaza, 4 ° C |
| BSA | % 1 |
| Sodyum azid | % 0,02 |
| PBS, pH 7.4 | 1x |
| FCM Tampon: | Mağaza, 4 ° C |
| Tris, pH: 7.4 | 50 mM |
| NaCl | 100 mM |
| Sodyum azid | % 0,02 |
| FBS | % 5 |
| PBS, pH 7.4 | 1x |
Kullanım hemen önce hazırlayın:
| EDAC-MES: | MES Kaplin Tampon 50 mg / ml EDAC tozu çözülür |
| Digitonin solüsyonu (% 2 w / v): | 95 ısıtarak dH 2 O digitonin toz çözülür ° C 5min sonra buz üzerinde soğutma |
| Lizis Tampon: | |
| Tris, pH: 7.4 | 50 mM |
| NaCl | 150 mm |
| Digitonin çözüm | % 1 |
| Proteaz inhibitörleri | 1x |
| Buz üzerinde saklayın |
1. Boncuk için mAb çiftlenmesi
- PBS içinde seyreltilmesi ve bir hemasitometre sayım tarafından satın alınan stok boncuk konsantrasyon belirleyin. Sayımı için boncuk 1:10000 seyreltme ile başlayın.
- Pipet 18 x 1.5 ml mikrosantrifüj tüpe 10 6 boncuk.
- Her yıkamadan sonra, 25 3 dakika 20.000 g ° C santrifüj, 0,5 - 1,0 ml MES Kaplin Tampon boncuk, 2 ya da 3 kere yıkayın.
- 50 mcL MES Kaplin Tampon boncuklar tekrar
- Taze hazırlanmış EDAC-MES 20 mcL ekleyerek boncuklar karboksil grubu etkinleştirin.
- , 25 ° C'de elle yukarı ve aşağı pipetleme 15 dakika süreyle hafifçe karıştırın.
- 25 3 dakika 20.000 g de santrifüj ° C Her yıkamadan sonra, 0,5 ila 1,0 ml PBS aktive boncuk, 2 ya da 3 kere yıkayın.
- 50 mcL PBS içinde aktif boncuk süspanse edin.
- Aktive boncuk çözüm IP mAb (0,2-1,0 mg / ml stok konsantrasyonu) 50 mcL ekleyin.
- 25 ° C'de 3 ila 4 saat titreşimli çalkalayıcı tüp koyarak karıştırın. Tüpün alt boncuk yerleşme önlemek için yeterince çalkalayınız.
- Yıkama mAb birleştiğinde boncuklar her yıkamadan sonra 0,5 - 1,0 mL PBS içinde 2 - 3 kez, 3 dakika 25 ° C 20.000 g de santrifüj.
- 100 mcL QBS Tampon boncuklar tekrar Bu 4 ° C'de saklanabilir
- Boncuk askıya iyi, PBS içinde 1:200-1:10,000 sulandırmak ve bir hemasitometre ile saymak. Konsantrasyonu her IP veya pull-down deneyde kullanılan boncuk sayısı tam olarak kontrol altına alınabilir, böylece, her preparatif parti için ölçülebilir olmalıdır.
2. Post-nükleer Lizat Hazırlama ve Ip
Lizis yöntemi ve optimal lizis koşulları, hücre tipi ve protein-protein etkileşimleri incelenmektedir bağlıdır. Protokolleri bir dizi var ve uygulama için modifiye edilebilir.
- Lenfositler, veya 5 gibi 20 x 10 6 'küçük' hücreleri, Lyse x 10 makrofajlar ya da tümör hücrelerinin gibi 6 'büyük' hücreleri, buz üzerinde 20 dk için 1.5 mL mikrosantrifüj tüp 100 mcL taze Lizis tampon . Gerektiği gibi lizis hacmi Ölçeği.
- Çekirdek ve çözünmez hücresel enkaz kaldırmak için, 20.000 g de 10 dakika 4 ° C lizat santrifüj Süpernatantı tutun ve pelet iptal.
- Karıştırmak için hafifçe pipetleme 0.5 x 10 açıklık lizat 5 ila 2,5 x 10 5 mAb çiftli boncuk, ekleyin. Minimum hacim için kullanabileceğiniz5 mcL tek bir IP gerçekleştirmek.
- Dikey dönen bir tekerlek 4 saat gecede soğuk bir odaya yerleştirin. Boncuk yerleşmesini önlemek için yeterli hızına ayarlayın. Bu dönüşü sırasında tüpün alt kalmaya, düşük hacimli IP sıvı için kabul edilebilir.
3. Boncuk çekilen Protein Florokrom konjuge antikorlar ile problama
- 4 20.000 g santrifüj ° C Her yıkamadan sonra 3 dakika, 0,2 ila 1,0 mL buz FCM Tampon IP boncuk iki kez yıkayın.
- Beş veya daha fazla bir baca alt plakası 1.5 mL mikrosantrifüj tüpler veya kuyuların her birine 100 mcL FCM Tampon ve kısım 20 mcL boncuk tekrar
- Örnekleri florokrom-konjuge mAbs ekleyin. FCM üreticinin talimatlarına göre veya ampirik olarak tespit yoğunluklarına göre leke gerçekleştirin. Tüp başına ya da iyi bir başlangıç noktası olarak, hisse senedi antikor çözüm 0,2-1 mcL (0,2-1,0 mg / ml) ekleyin ve 40 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- Yıkama 1,0 mL buz FCM Tampon 4 20.000 g de santrifüj 1.5 ml tüpler iki kez boncuk probed ° C her yıkamadan sonra 3 dakika. Yavaşça, boncuklar rahatsız etmemek için özen, her yıkamadan sonra süpernatantı çıkarın. Baca alt plaka, 4, 5 dakika boyunca 1000g santrifüj, 0.2 ml buz FCM Tampon ile iki kez yıkamak ° C Her yıkamadan sonra. Bir çok kanallı pipet bu adım için yararlıdır. Bir baca alt plakası boncuk süpernatant kaldırmak için, plaka 'hareketiyle bir kez, sonra, hala baş aşağı iken, kuyuların kenarlarında herhangi bir damlar kurulayın. Her kuyuda rezidüel hacim, boncuklar içeren yaklaşık 20 mcL.
- Numune başına 200 mcL FCM Tampon boncuklar tekrar Etiketli FACS tüpler aktarın. Örnekleri FCM hazır.
4. FCM Acquisition
Bu protokol açıklanan KML boncuklar, çapı 3 ila 5 mikron, suskun bir fare lenfosit çapı yaklaşık yarısı. Bu nedenle, bu ölçekte kayıt boncuk olayların nüfus için elle Forward Scatter (FSC) amfi kazanç ve Side Scatter (SSC) gerilimi artırmak için gerekli olabilir. Bireysel IP boncuk tek bir sıkı kümelenmiş nüfus oluşturmalıdır. Ayarları ve kapı boncuk çiftlerin ve enkaz dışlamak için ayarlanabilir olmalıdır.
- Önce çalışan boncuk boncuk standartları, bazı sitometrelerinde numune girişi çevreleyen damlacık çevreleme kol çıkarın. Bu giriş temizlemek ve başka bir örnek üzerinden yürütülmektedir boncuk önleyecek şekilde kılıf sıvı örnekleri arasında damla izin verin.
- Negatif ve pozitif floresan aşırı log ölçekli x ekseni aynı anda görünecek şekilde ayarlarını etiketsiz boncuk, floresan bir negatif kontrol ve Rainbow Kalibrasyon Parçacıklar (RCPs), floresan bir pozitif kontrol, kullanın. Bu deneysel örneklerinden floresan ölçekli olacağını garanti eder. Böylece FSC ve SSC parametrelerin yanı sıra kapı konumu, geçici olarak bu örnek için değişiklik gerekebilir RCPs KML boncuk daha küçük olduğunu unutmayın.
- RCPs ile kalibrasyon tamamlandıktan sonra etiketsiz-boncuk ayarlarına geri dön. Örnek başına sadece bir floresan prob kullanılması durumunda, hiçbir floresan tazminat gereklidir. Genel olarak, tek başına bir FCM örnek florokrom-konjuge mAb ile multiprotein kompleksleri probu, ve çeşitli alt birimden özel mAbs paralel boncuk örnekleri boyama ile birden fazla etkileşim ortakları incelemek.
- Floresan veri dosyaları Edinme ve kaydedin. Analizi sonra flow sitometri gibi CellQuest, FlowJo yazılım veya CFlow kullanılarak yapılabilir.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1. Fare suşu TCR/CD3 multiprotein kompleksi için IP-FCM T hücreleri BALB / c 1% digitonin parçalanan, ve anti-CD3ε boncuklar kullanarak IP-FCM lizat maruz kaldı. Yakalanan kompleksleri TCR-β önemli miktarda (mor bölge) bulunan ve co-ilişkili CD3-ε (yeşil), ancak yakın gibi Thy1.2 gibi diğer proteinlerin arka plan düzeyleri (alakasız immünglobulin probu, pembe iz tarafından tanımlanan), CD45, ya da H-2K (d) (kahverengi, turuncu ve mavi izleri, sırasıyla). Daha önce yayınlanmış benzer sonuçlar: 1-6.
Discussion
Protein-protein etkileşimleri hakkında bilgiler, sinyal iletimi, soy olgunlaşma, hücre döngüsü ilerlemesi, ve apoptozis kaskadlar gibi birçok hücresel süreçlerin analiz son derece alakalı. IP FCM proteinlerin etkileşimi incelemek ve kendi ana yapısındaki multiprotein kompleksleri üyeleri tanımlamak için, hızlı, kantitatif ve hassas bir şekilde sağlar. Boncuk ve hücre lizatları ile inkübe birleştiğinde, bir günde ve probed ve ertesi gün analiz edilebilir olabilir. 96-plaka biçimi, etkin veri toplama, istatistik veya tarama amacıyla sağlamak için bir anda analiz edilmesi gereken çok sayıda numune sağlar. Floresan boncuk standartlarını kullanarak, her bir boncuk tarafından yakalanan proteinlerin sayısını tahmin edilebilir. Çok küçük kaynak materyal yakalama ve tespiti için gerekli, bu yüzden sınırlı örnekler ve kıt analitler hala çok etkileşim için analiz edilebilir. IP-FCM fizyolojik olmayan bir ortamda proteinlerin karıştırma, genetik mühendisliği, epitop etiketleme, denatürasyon, ya da in-vitro gerektirmese de, uygulanabilirliği ile erişilebilir ve değerli bir araç, bu ve diğer teknikler ile birleştiğinde olabilir birçok biyolojik sistemler.
Sorun Giderme:
Birçok IP FCM deneyler yararlı protein etkileşim verileri ilk kez denenir üretir. Ancak, IP-FCM optimizasyonu, boncuk, protein kompleksi yakalama ve bağlayıcı floresan prob antikor konjugasyon artırabilir.
IP antikor konjugasyon verimliliği doğrudan bir anti-immünglobulin antikor ile birleştiğinde boncuk problama tarafından tespit edilebilir. Bu verimliliği düşükse, kaplin reaksiyon sırasında antikor konsantrasyonunu arttırarak daha fazla IP antikorları her boncuk takmak için izin verebilirsiniz. Bu analitlerin gelişmiş yakalama ve algılama, IP boncuk toplu bağlama kapasitesi artırabilir. Diğer birincil amin içeren moleküllere (örneğin Tris, sığır serum albumin), bu düşük mAb kaplin boncuk eki ve sonuç için mAb ile rekabet gibi kaplin reaksiyon sırasında mevcut olmamalıdır. Boncuk mAb konjugasyon başka nedenlerden dolayı sorun olursa, boncuk yerine avidin / streptavidin birleştiğinde olabilir ve biotinlenmiş antikorlar daha sonra non-kovalent bağlı immunprecipitation için kullanılan olabilir.
Iyi antikor konjugasyon rağmen, boncuk ilişkili floresan ilk algılama düşük olabilir. Birincisi, karmaşık yakalama kendisi düşük olabilir. IP-FCM, birim lizis hacim başına parçalanan hücrelerin sayısı artan analit konsantrasyonuna bağlı olduğundan analit yakalama ve algılama artırabilir. Ayrıca, yakalama, yakalanan az boncuklar arasında kompleksleri, ve probed boncuk başına ortalama floresan sonuçları dağıtır lizat ile inkübe IP boncuk sayısının azaltılması artabilir. İkincisi, yakalanan kompleksleri prob antikor erişim sterik immunoprecipitating antikor tarafından engellendiği mümkündür. Bu durumda, sorun ve / veya prob yakalamak için farklı antikorları kullanarak ele alınabilir.
Acknowledgments
Bu çalışma Eagles İnovasyon Ödülü (Eagles Kardeş Sipariş) ve Mayo Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free) | Reagent | Interfacial Dynamics | 2-5000 | Store at 4°C. |
| Rainbow Calibration Particles | Reagent | Spherotech, Inc. | RCP-30-5A | Store at 4°C. |
| 2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES) | Reagent | Sigma-Aldrich | M-5287 | |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC) | Reagent | Sigma-Aldrich | 22980 E-6383 | Store at -20°C under desiccating conditions. |
| Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin | Reagent | Sigma-Aldrich | P-2714 | Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20°C. Handle with gloves. |
| PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney | Reagent | Fisher Scientific | 08-408-230 | For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining |
References
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).
- Schrum, A. G. Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).
- Teixeiro, E. T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains. Immunity. 21, 515-526 (2004).
- Teixeiro, E. Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development. Science. 323, 502-505 (2009).
- Treves, S. Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion. J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).
- Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes. J Exp Med. 201, 517-522 (2005).
