Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Bacteriële Gene Expression analyse met behulp van Microarrays

Published: May 28, 2007 doi: 10.3791/206

Summary

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Reverse transcriptase reactie

Draai verwarming blok naar 70-80 ° C en 42 ° C. Waterbaden kan ook gebruikt worden in deze stap. Bij gebruik van verwarmings-blokken, dus zet wat water dat de warmte uniform is.

  1. Priming reactie
    1. Neem 3 pg RNA
    2. Volume aan te passen tot en met 13 ul met RNase vrij water
    3. Voeg 2,5 ul van willekeurige hexameer primers (2mg/mL)
  2. Meng goed en incuberen bij 70-80 ° C gedurende 8 minuten. Dan, plaats op ijs gedurende 5 minuten.
  3. Bereid RT cocktail (14,5 ul / rxn):

    Bestanddeel Volume
    5X Eerste Strand buffer 6 pl
    0,1 M DTT
    3 pl
    25X aminoallyl-dNTP mix 1,2 pl
    Superscript II RT (200U/μl) 2,3 pl
    Water
    2,0 pl

    * Voor n reacties, voor te bereiden Master Mix voor n +0.5 fracties van de cocktail te verzekeren dat u niet zal opraken.

  4. Voeg 14,5 ul aan gekoelde reacties.
  5. Mix (niet vortex) en incubeer bij 42 ° C gedurende 3-4 uur
  6. Monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C indien nodig.

Hydrolyseren RNA

  1. Aan elk monster, voeg 3 pl van 1 N NaOH en 0,6 pi 0,5 M EDTA. (Final conc.s = 100mm NaOH, 10mm EDTA)
  2. Mix en incubeer bij 65 ° C gedurende 10 minuten.
  3. Neutraliseren door het toevoegen van 33,6 ul 1 M HEPES, pH = 7,0 (laatste conc .= 500mm HEPES)
  4. Monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C, indien nodig.

Reactie Zuivering: Verwijderen van zonder rechtspersoonlijkheid aa-dUTP en vrije aminen

Opmerking: Deze zuivering protocol is gewijzigd ten opzichte van de Qiagen QIAquick PCRpurification kit protocol. Het fosfaat wassen en elutiebuffers zijn vervangen door de meegeleverde Qiagen buffers omdat de Qiagen buffers bevatten vrij amines die concurreren met de Cy kleurstof koppelingsreactie. De kolommen van de mini-prep-kit kan ook gebruikt worden.

  1. Meng cDNA reactie met 300 ul (of 5x reactie volume = 336 ul) buffer PB (Qiagen meegeleverd) en over te dragen aan QIAquick kolom.
  2. Plaats de kolom in een 2 ml collectie buis (Qiagen meegeleverd) en centrifugeer bij ~ 13000 rpm gedurende 1 minuut. Lege verzameling buis.
  3. Om zich te wassen, voeg 750 ul fosfaat-wasbuffer (niet Qiagen's) naar de kolom en centrifugeer bij ~ 13000 rpm gedurende 1 minuut.
  4. Leeg de verzamelbuis en herhaal de 750 ul wassen en centrifugeren stap.
  5. Leeg de collectie buis en centrifugeer de kolom een ​​extra 1 minuut bij maximale snelheid.
  6. Transfer kolom naar een nieuwe 1,5 mL microfugebuisje en voorzichtig 30 pl fosfaat elutiebuffer. (Zie oplossing voorbereiding sectie)
  7. Incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
  8. Elueer door centrifugeren bij ~ 13.000 rpm gedurende 1 minuut.
  9. Elueren een tweede keer (met een andere 30 ul van fosfaat elutiebuffer) in dezelfde buis door het herhalen van de stappen 6-8. Het uiteindelijke elutievolume moet ~ 60 ul worden.
  10. De hoeveelheid cDNA kunnen worden gekwantificeerd in deze fase:
    ng cDNA = (verdunningsfactor) (OD260) (37) (totaal volume geëlueerd uit kolom)
  11. Monster in een Speed ​​Vac bij 45 ° C.
  12. Monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C indien nodig.

Koppeling aa-cDNA te Dye Ester Cy

  1. Resuspendeer aminoallyl-gelabeld cDNA met 10 ul 50 mM Na-bicarbonaat, pH = 9,0 indien nodig. (Deze buffer moet worden vers gemaakt om de twee weken)
  2. Werken in een donkere plaats, voeg de sonde aan een buis van de juiste Cy kleurstof. Pipet op en neer meerdere malen op de kleurstof mengen.
  3. Incubeer de reactie gedurende 1 uur in het donker bij kamertemperatuur. (Incubatie kan oplopen tot twee uur)

Reactie Zuivering II: Verwijdering van afgekoppelde kleurstof

  1. Aan het reactiemengsel toe te voegen 35 pl 100 mM NaOAc pH 5,2. Meng goed.
  2. Voeg 250 ul (of 5x reactie volume = 225 pl) Buffer PB (Qiagen meegeleverd) aan elk monster en meng door en neer te pipetteren.
  3. Plaats een QIAquick spin-kolom in een 2 ml collectie buis (Qiagen meegeleverd), past u het monster op de kolom en centrifugeer bij ~ 13.000 gedurende 1 minuut. Lege verzameling buis.
  4. Om zich te wassen, voeg 0,75 ml Buffer PE (Qiagen bijgeleverd) om de kolom en centrifugeer bij ~ 13.000 gedurende 1 minuut.
  5. Herhaal stap 4.
  6. Lege verzameling buis en centrifugeer kolom voor een extra 1 minuut bij maximale snelheid.
  7. Plaats kolom in een schoon 1,5 ml microfugebuisje en voorzichtig 30 ul buffer EB (Qiagen bijgeleverd) aan op het midden van de kolom membraan.
  8. Incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
  9. Elueer door centrifugeren bij ~ 13.000 rpm gedurende 1 minuut.
  10. Elueren een tweede keer in dezelfde buis door het herhalen vanstappen 7-9. De laatste geëlueerd volume moet ~ 60 ul worden.

Analyse van de labeling reactie

De hoeveelheid cDNA en label gekwantificeerd kan worden in deze fase:

  • Meten OD 260, 550 en 650 (Blank is water.) Gebruik nanodrop microarray-programma.
  • Bereken de pmol van kleurstoffen oprichting en pmol DNA en nuc / dye-verhouding met de gegeven vergelijkingen hieronder:

    pmol nucleotiden = [OD260 * volume (pi) * 37 ng / ul * 1000 pg / ng] / 324,5 pg / pmol

Let op: 1 OD260 = 37 ng / ul voor cDNA; 324,5 pg / pmol gemiddeld moleculair gewicht van een dNTP)
pmol Cy3 = OD550 * volume (pi) / 0,15
pmol Cy5 = OD650 * volume (pi) / 0,25
nucleotiden / dye ratio = pmol cDNA / pmol Cy dye

Als u gebruik maakt nanodrop, het geeft al pmol / ul voor elke kleurstof. U hoeft alleen dit aantal vermenigvuldigen met het volume van de totale pmol kleurstof incorporatie te krijgen.

Let op:> 150 tot 200 pmol van de kleurstof oprichting per monster en een verhouding van minder dan 20 nucleotiden / kleurstofmoleculen is optimaal voor kruisingen.

  • Monsters kunnen worden bewaard bij -20 ° C bij donker.
    • Combineer probes worden gehybridiseerd samen en droog in speedvac bij 42 ° C.
    • Monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C tot klaar te hyb.

Pre-hyb slides

  1. Plaats glijden naar beneden dan RT 100 ml water in een schone rode glijbaan houder gedurende 3-5 minuten
  2. Snap droog de foto door het plaatsen van het gezicht op een 100 ° C verwarmen blok voor een paar seconden - horloge voor de condensatie te verdwijnen
  3. UV cross-link de foto op 250 mJoules (Voer 2500 tot de UV-crosslinker)
  4. Hydrate dia's door dompelen in voorverwarmde 42 ° C water. Spin 5 min op 700 RPM bij RT.
  5. Broed dia's in 50 ml Coplin pot met voorverwarmde pre-hyb (5XSSC, 1% BSA, 0,1% SDS) voor ten minste 45 minuten @ 42 ° C, en incubatie kan langer gaan indien nodig.

    50 ml pre-hyb buffer: 12,5 ml 20x SSC, 10 ml 5% BSA, 0,5 ml 10% SDS, 27 ml water

  6. Dipslides in voorverwarmde water (42 ° C) en schud een paar minuten voor pre-hyb buffer te verwijderen.
  7. Spoel in isopropanol en spin 5 min bij 700 rpm, kamertemperatuur, om te drogen.

Voorbereiding van de monsters voor hybridisatie

  1. Resuspendeer sonde in het water (volumes worden hieronder gegeven)

    Voor de totale vol. = 30μl
    Voor de totale vol. = 35μl
    Voor de totale vol .= 40μl
    19,8 ul water
    23.55 ul water
    27,2 ul water

    1,5 pl 1,5 pl 1,5 pl 10 mg / ml zalmsperma DNA (Invitrogen)
    1,2 pl 1,2 pl 1,2 pl 12,5 mg / ml tRNA
    4,5 pl 5,25 ul 6 pl 20XSSC (3X definitief)
    3 pl 3,5 pl 4 pl 1% SDS

    Opmerking: De volgorde van toevoeging van de reagentia zijn belangrijk. Niet voor te bereiden master mix.

  2. Kook gedurende 5 minuten, dan draaien 5 minuten bij 14.000 rpm. Cool gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.

Hybridisatie

  1. Voeg 10 tot 12 pl 3x SSC aan de putjes van de hybridisatie kamer op elke rand en in het midden.
  2. Voeg een schone lifter slip naar het gewenste gebied van de dia en voorzichtig belasting in hybridisatie-oplossing (30 -40 pl). Er moet een extra monster op de randen van het dekglas worden.
  3. Plaats de dia in de kamer. 'S nachts draai de schroeven en plaats in een 65 ° C waterbad. Niet direct plaatsen van de kamer op de bodem van het water bad. Plaats een blok op de top van de bovenste kamer om alles op zijn plaats. Houd het deksel op het waterbad om de lichtgevoelige monsters te beschermen.

Hyb Wast

  1. Bereid de volgende buffers:
    • 1X SSC, 0,05% SDS
    • 0.06 X SSC
  2. Na de incubatie ontsluiten hybridisatie kamer. Haal de dia uit de kamer, zorg ervoor dat u het dekglaasje verstoren.
  3. Om dekglaasjes verwijderen, onderdompelen dia's in een schotel met warm 1X SSC, 0,05% SDS wasbuffer dekglaasje met uitzicht op de bodem van de schaal. Het dekglaasje wordt af te vallen door het bewegen van de schuif van links naar rechts.
  4. Nadat het dekglaasje is verwijderd, plaatst u de dia in een rack een vers bad met warm 1XSSCm 0,05% SDS. Agiteren voor een paar minuten
  5. Overdracht dia's plus rek aan een bad van 0,06 X SSC.
  6. Overdragen naar een andere dia bae van 0,06 X SSC met een frisse rek, blotting de dia op een papieren handdoek om zoveel SDS-bevattende buffer als mogelijk te verwijderen alvorens deze in het frisse bad.
  7. Agiteren dia's voor een paar minuten.
  8. Spin onmiddellijk bij kamertemperatuur gedurende 5 min @ 700 rpm, dan dia's zijn klaar om te scannen. Bewaren in het donker tot gescand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
AA-dUTP Sigma-Aldrich A0410 5-(3-aminoallyl)-2’deoxyuridine-5’-triphosphate
dNTP Amersham 27-2035-01 100 mM dNTP Set PCR grade
Random Hexamer primers Amersham 27-2166-01 3mg/mL
SuperScript III RT Invitrogen 80800444 200U/μL
CyDye™ Amersham RPN5661 Post-Labelling Reactive Dye Pack
QIAquick Qiagen 28104 PCR Purification kit
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4 Buffer To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4
Phosphate wash buffer Buffer For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily.
Phosphate elution buffer Buffer Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water
Sodium Carbonate Buffer (Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hasseman, J. TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for. Microarrays & TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization. Forthcoming.
  2. Gilbert,, et al. TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays & Hybridization of probed labels. Forthcoming.
  3. Hedge,, et al. A concise guide to cDNA Microarray analysis-II. Forthcoming.
Bacteriële Gene Expression analyse met behulp van Microarrays
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beyhan, S., Yildiz, F. Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays. J. Vis. Exp. (4), e206, doi:10.3791/206 (2007).More

Beyhan, S., Yildiz, F. Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays. J. Vis. Exp. (4), e206, doi:10.3791/206 (2007).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter