Bakteriell Gene Expression Analysis Använda Microarrays

Summary

Protocol

Omvänt transkriptas Reaktion

Vänd värmeblock till 70-80 ° C och 42 ° C. Vattenbad kan också användas i detta steg. Om du använder värme block, sätta lite vatten så att värmen är jämn.

1. Grundning reaktion
   1. Ta 3 mikrogram av RNA
   2. Justera volymen till 13 l med RNas fritt vatten
   3. Tillsätt 2,5 l av slumpmässiga hexamer primers (2mg/mL)
2. Blanda väl och inkubera vid 70-80 ° C i 8 minuter. Sedan placera på is i 5 min.
3. Förbered RT cocktail (14,5 l / rxn):
   
   

   Komponent	Volym
   5X First Strand buffert	6 l
   0,1 M DTT	3 l
   25X aminoallyl-dNTP mix	1,2 l
   Upphöjd II RT (200U/μl)	2,3 l
   Vatten	2,0 l

   
   * För n reaktioner, förbereda Master Mix för n 0,5 alikvoter av cocktail för att försäkra att du inte tar slut.
   
   
4. Lägg till 14,5 l till kyld reaktioner.
5. Blanda (inte vortex) och inkubera vid 42 ° C i 3-4 timmar
6. Prover kan förvaras vid -20 ° C vid behov.

Hydrolysera RNA

1. För varje prov, tillsätt 3 l 1 N NaOH och 0,6 l av 0,5 M EDTA. (Final conc.s = 100mm NaOH, 10mm EDTA)
2. Blanda och inkubera vid 65 ° C i 10 minuter.
3. Neutralisera genom att lägga till 33,6 l 1M HEPES, pH = 7,0 (sista Konc .= 500mm HEPES)
4. Prover kan förvaras vid -20 ° C, om det behövs.

Reaktion Rening: Borttagning av unincorporated AA-dUTP och fria aminer

Obs: Denna rening protokoll ändras från Qiagen QIAquick PCRpurification kit-protokollet. Den fosfat tvätta och buffertar eluering ersätts för medföljande Qiagen buffertar eftersom Qiagen buffertar innehåller fria aminer som konkurrerar med Cy dye kopplingen reaktion. Kolumnerna från mini-prep kit kan också användas.

1. Blanda cDNA reaktion med 300 l (eller 5X reaktion volym = 336 l) buffert PB (Qiagen medföljer) och transfer till QIAquick kolumn.
2. Placera kolonnen i ett 2 ml provrör (Qiagen medföljer) och centrifugera vid ~ 13.000 rpm i 1 minut. Tomma provröret.
3. Att tvätta, lägga till 750 l buffert fosfat tvätta (inte Qiagens) till kolonnen och centrifugera vid ~ 13.000 rpm i 1 minut.
4. Töm provröret och upprepa 750 l tvätt och centrifugering steg.
5. Töm insamling röret och centrifugera kolumnen ytterligare 1 minut vid maximal hastighet.
6. Överför kolumn till en ny 1,5 ml mikrofugrör och tillsätt försiktigt 30 l buffert fosfat eluering. (Se avsnitt lösning förberedelse)
7. Inkubera i 1 minut vid rumstemperatur.
8. Eluera genom centrifugering vid ~ 13.000 rpm i 1 minut.
9. Eluera en andra gång (med ytterligare 30 l fosfat eluering buffert) i samma rör genom att upprepa steg 6-8. Den slutliga elutionsvolymen skall vara ~ 60 l.
10. Mängden cDNA kan kvantifieras i detta skede:
    ng cDNA = (spädningsfaktor) (OD260) (37) (totala volymen elueras från kolonnen)
11. Torka provet i en hastighet VAC vid 45 ° C.
12. Prover kan förvaras vid -20 ° C vid behov.

Koppling aa-cDNA att Cy Dye Ester

1. Resuspendera aminoallyl-märkt cDNA med 10 l 50 mM Na-bikarbonat, pH = 9,0 om det behövs. (Denna buffert bör göras färsk varannan vecka)
2. Att arbeta på en mörk plats, lägga sonden i en tub av lämplig Cy färgämne. Pipettera upp och ner flera gånger för att resuspendera färgämne.
3. Inkubera reaktionen i 1 timme i mörker vid rumstemperatur. (Inkubation kan gå upp till två timmar)

Reaktion Rening II: Borttagning av okopplade färgämne

1. För att reaktionen lägga 35 l 100 mM NaOAc pH 5,2. Blanda väl.
2. Tillsätt 250 l (eller 5X reaktion volym = 225 l) buffert PB (Qiagen medföljer) till varje prov och blanda genom att pipettera upp och ned.
3. Placera en QIAquick snurra kolumn i en 2 ml provrör (Qiagen medföljer), använda provet till kolonnen och centrifugera vid ~ 13.000 för en minut. Tom samling rör.
4. Att tvätta, lägga till 0,75 ml buffert PE (Qiagen medföljer) i kolonnen och centrifugera vid ~ 13.000 för en minut.
5. Upprepa steg 4.
6. Tomma provröret och centrifugera kolumnen för ytterligare 1 minut vid maximal hastighet.
7. Placera kolonnen i ett rent 1,5 ml mikrofugrör och tillsätt försiktigt 30 l buffert EB (Qiagen medföljer) till mitten av kolumnen membranet.
8. Inkubera i 1 minut vid rumstemperatur.
9. Eluera genom centrifugering vid ~ 13.000 rpm i 1 minut.
10. Eluera en andra gång i samma rör genom att upprepasteg 7-9. Den slutliga elueras volymen bör vara ~ 60 l.

Analys av märkningsreaktionen

Mängden cDNA och etikett kan kvantifieras i detta skede:

• Mät OD 260, 550 och 650 (Blank är vatten.) Använd nanodrop microarray-programmet.
• Beräkna pmol av färgämnen bolagsordning och pmol DNA och kärn / färg förhållande med givna ekvationerna nedan:
  
  pmol nukleotider = [OD260 * volym (mikroliter) * 37 ng / mikroliter * 1000 pg / ng] / 324,5 pg / pmol

Anm: 1 OD260 = 37 ng / mikroliter för cDNA, 324,5 pg / pmol genomsnittlig molekylvikt av en dNTP)
pmol Cy3 = OD550 * volym (mikroliter) / 0,15
pmol Cy5 = OD650 * volym (mikroliter) / 0,25
nukleotider / färgämne ratio = pmol cDNA / pmol Cy färgämne

Om du använder nanodrop, det ger redan pmol / l för varje färgämne. Du behöver bara multiplicera detta tal med volym för att få total pmol färgämne bolagsordningen.

Obs:> 150-200 pmol färgämne inbyggnad per prov och en ratio på mindre än 20 nukleotider / färg molekyler är optimal för hybridizations.

• Prover kan förvaras vid -20 ° C vid mörker.
  • Kombinera sonder vara hybridiseras tillsammans och torrt i speedvac vid 42 ° C.
  • Prover kan förvaras vid -20 ° C tills den ska Hyb.

Pre-Hyb diabilder

1. Placera glida nedåt över RT 100 ml vatten i en ren röd hållare i 3-5 minuter
2. Snap torra bilden genom att placera framsidan upp på en 100 ° C värmeblock i några sekunder - se för kondens försvinna
3. UV cross-link bilden vid 250 mJoules (Enter 2500 till UV crosslinker)
4. Hydrate diabilder genom att doppa i förvärmda 42 ° C vatten. Spin 5 min vid 700 rpm vid RT.
5. Inkubera objektglasen i 50 ml Coplin JAR innehåller förvärmas före Hyb (5XSSC, 1% BSA, 0,1% SDS) i minst 45 minuter @ 42 ° C, och inkubationstiden kan gå längre om det behövs.
   
   50 ml i förväg Hyb buffert: 12,5 ml 20x SSC, 10 ml 5% BSA, 0,5 ml 10% SDS, 27 ml vatten
   
   
6. Doppa glasen i förvärmda vattnet (42 ° C) och skaka ett par minuter för att ta bort före Hyb buffert.
7. Skölj i isopropanol och snurra 5 min vid 700 rpm, rumstemp, för att torka.

Förbereda prover för hybridisering

1. Resuspendera sond i vatten (finns volymer som anges nedan)
   
   

   För total vol. = 30μl	För total vol. = 35μl	För total vol .= 40μl
   19,8 l vatten	23,55 l vatten	27,2 l vatten
   1,5 l	1,5 l	1,5 l	10 mg / ml lax spermiens DNA (Invitrogen)
   1,2 l	1,2 l	1,2 l	12,5 mg / ml tRNA
   4,5 l	5,25 l	6 l	20XSSC (3X slutlig)
   3 l	3,5 l	4 l	1% SDS

   
   Notera: Ordningen tillägget av reagenser är viktiga. Bered inte Master Mix.
   
   
2. Koka i 5 minuter och sedan snurra 5 minut vid 14.000 rpm. Svalna i 2 min vid rumstemp.

Hybridisering

1. Tillsätt 10-12 ìl 3X SSC till brunnarna för hybridisering kammare på varje kant och i mitten.
2. Lägg en ren lyftare glida till rätt område i bilden och försiktigt belastning i hybridisering lösning (30 -40 l). Det bör vara extra prov på antingen kanten av locket halka.
3. Placera bilden i kammaren. Dra åt skruvarna och lägg i en 65 ° C vattenbad över natten. Placera inte kammaren direkt på botten av vattenbad. Placera ett block ovanpå det översta kammaren att hålla allt på plats. Håll locket på vattenbad för att skydda ljuskänsliga prover.

Hyb Tvättar

1. Förbered följande buffertar:
   • 1X SSC, 0,05% SDS
   • 0,06 X SSC
2. Efter inkubation bryta förseglingen hybridisering kammare. Ta bort bilden från kammaren, se till att inte störa täckglas.
3. För att ta bort täckglas, sänk bilder i en skål med varmt 1X SSC, 0,05% SDS tvättbuffert täckglas vänd ner i skålen. Den täckglas kommer ramla av genom att flytta bilden i sidled.
4. Efter täckglas tas bort, placera bilden i ett rack en fräsch bad med varma 1XSSCm 0,05% SDS. Agitera för ett par minuter
5. Överför bilder plus rack till ett bad med 0,06 X SSC.
6. Överför bilder till en annan bae 0,06 X SSC som innehåller en ny rack, blotting bilden på en pappershandduk för att avlägsna så mycket SDS innehåller buffert som möjligt innan de placeras i nya badet.
7. Skaka diabilder i ett par minuter.
8. Spin omedelbart vid rumstemperatur i 5 min vid 700 rpm, då bilderna är redo att skanna. Förvara i mörker tills skannas.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-aminoallyl)-2’deoxyuridine-5’-triphosphate
dNTP		Amersham	27-2035-01	100 mM dNTP Set PCR grade
Random Hexamer primers		Amersham	27-2166-01	3mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200U/μL
CyDye™		Amersham	RPN5661	Post-Labelling Reactive Dye Pack
QIAquick		Qiagen	28104	PCR Purification kit
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4	Buffer			To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4
Phosphate wash buffer	Buffer			For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily.
Phosphate elution buffer	Buffer			Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water
Sodium Carbonate Buffer				(Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month.