Summary
偽骨折、無菌筋骨格系の外傷の再現性のマウスモデルは、後期長期外傷後の免疫応答の評価することができます。この記事では、複数の外傷の研究を可能にするために実験モデルの組み合わせの可能性を含む、ステップごとのモデルの段階の手続きの実行を、説明します。
Abstract
外傷に続いて多臓器不全と外傷患者の高い死亡率につながることができる初期のハイパー反応性炎症反応があり、この応答は、しばしば感染症の臨床的合併症を追加する遅延免疫抑制を伴っているとも死亡率を増加させることができる1-9。多くの研究は、外傷に続く免疫系の反応性にこれらの変化を評価し始めている。10-15
免疫応答に関与する分子経路を評価するために詳細な調査で、これらの株の援助16から21、免疫学的研究は大幅にin vivoでのモデリングで使用可能なトランスジェニックやノックアウトマウスのさまざまなを介してサポートされています。
マウスでは骨折固定技術は、複雑で簡単に再現できないことができるように実験的なマウス外傷のモデリングにおける課題は、長期的な調査です。22から30
動物の移動の自由と麻酔の継続的、長期使用せずに長期生存を可能にしながらこの偽骨折モデル、簡単に再現外傷モデルでは、免疫学的に四肢の骨折の環境を模倣することで、これらの困難を克服しています。目的は、長骨の骨折の特徴を再現することです。負傷筋肉や軟組織がネイティブ骨を壊すことなく、損傷した骨や骨髄にさらされている。
後肢に二国間の筋肉の挫滅、これらの負傷者の筋肉に骨液の注入に続いて：偽骨折モデルは、2つの部分から成ります。骨のソリューションは、年齢と体重をマッチさせた同系ドナーの両方後肢から長骨を採取することによって調製される。これらの骨は、粉砕し、リン酸に再懸濁されている骨のソリューションを作成するために緩衝生理食塩水。
二国間の大腿骨骨折は、四肢の外傷の一般的に使用されると十分に確立されたモデルであり、偽骨折モデルの開発中に比較モデルでした。我々は無菌まだ比例して重篤な末梢組織の外傷のモデルを望んでいたとして、利用可能な骨折モデルの様々の中で、我々は、偽骨折に対する我々の比較などの軟部組織損傷と骨折の閉鎖法を使用することにしました。31
出血性ショック、重度の外傷の設定で一般的な所見であり、グローバルな血流低下は、外傷のモデルに非常に関連する要素を追加します。32〜36偽骨折モデルは容易に高い重症の多発外傷モデルの出血性ショックモデルと組み合わせることができます。 。。37
Protocol
1。楽器と手術野の準備：
すべての実験手順は無菌操作を使用して実行されます。開始する前に、実験エリアは、徹底的に洗浄し、滅菌する必要があります。ベンチは空気乾燥し、70％アルコールでダウン拭くために許可され、消毒されるべきである。実験的な作業領域でドレッシング外科青いパッドと滅菌フィールドを配置します。
すべての材料や器具は、オートクレーブの使用前に滅菌されています。シリンジと針は滅菌受信されます。研究者は、適切な実験着と手術用マスク、および無菌手術用手袋身につけてされるべきである。
私たちの外科用器具はオートクレーブ毎晩滅菌されています。それらは抗菌石鹸と水を使用して手術後に洗浄されています。彼らはきれいな手術青いパッドの上に乾燥させる。次に、これらを注意深く滅菌袋に入れ、後で使用するために滅菌されています。
° F実験を開始する前に300から350 - それは適切な温度に達する保証するためにホットビーズ滅菌器の電源を入れます。この殺菌剤は、それぞれのマウスでの実験手順の間に楽器をきれいにするために使用されます。ステンレス鋼製器具のトレイを取得し、70％エタノールで道の1 / 3を埋めること。あなたの手術器具をカバーするのに十分な70％エタノールがあるはずです。循環加熱パッドをオンにし、それ以上の外科青パッドし、その上にドレッシング滅菌フィールドを配置します。このヒーターは、実験手順および回復期間中にマウスの十分な暖かさを確保するために使用されます。無菌フィールドドレッシング上のすべての滅菌器具、ガーゼ、注射器、注射針と1.5mlのマイクロ遠心チューブを置きます。あらゆる滅菌器具や他のアイテムを開くときは注意して、それらに触れることにより、それらを汚染しないでください。このセットアップ手順を行うときには、滅菌手袋を使用するのが最適です。
2。偽骨折モデル - 実験手順：
1。麻酔とマウスの位置の誘導。
Pentobarbitolの腹腔内注射（70mg/kg）を投与することによって始まります。これは最初の尾の近位端を使用してケージからマウスを持ち上げて実現されます。マウスはその後anaesthesicの正しい投与量を計算するために検討する必要があります。まだ尾を押しながら次の、ケージの上に動物を置く。ちょうど前足の後ろのマウスの両側に親指と中指でマウスの首の首筋をつかむ。人差し指がバックヘッド/首の領域で皮膚を引っ張ると、部分的に頭部を固定するために使用されます。薬指がマウスの背骨の腰部に押されている間にマウスの尾は、小指と薬指の間に開催されます。麻酔は、およそ5分以内に完全な効果を取るべきである、と反射テストで確認すべきである。
動物が眠っている後に、プレキシガラスのボードの上に仰臥位にマウスを置くと、その四肢をテープでそれらを固定するために緩やかなループテープの技術を使用してください。緩いループのテクニックは、単にテープの薄いストリップを切断し、各四肢の遠位部分の周りにゆるくテープを包む伴います。テープは、その後、自分自身に戻って貼り付けされ、テープ上の左側は、ボードに添付されます。これは一貫した方法だけでなく、より自然な位置を想定したマウスの四肢を確実に実行される実験的な操作が可能になります。動物の腹部、鼠径部、および大腿部の領域は、その後、滅菌フィールドを維持するために私たちのオスターA5のバリカン（サイズ40ブレード）を、使用して剃毛されています。 4x4のガーゼはbetadineでdousedされており、外科領域は、滅菌に消去されます。無菌フィールドドレッシングは、折り畳まれ、唯一の下肢と頭部の露出を可能にするためにマウスを介して掛けている。
固定および滅菌した後、実験手順を開始する前に数秒間マウスの鼻の上イソフルランでノーズコーンを配置。ノーズコーンは、ガーゼで満たされた50ccの円錐管で構成されています。チューブの下端の半分は中に収まるようにマウスの鼻のためのスペースを作成切り出している。キャップ（組織貯蔵容器すなわちストレートサイド広口瓶の底）は使用しないときは、イソフルラン蒸気がチューブに残っていることを確認するために円錐形の切り口の上に配置されます。イソフルランの一つmLをコーン内にガーゼに追加する必要があります。細心の注意は、麻酔の使用中にマウスに支払われ、特にノーズコーンを介してイソフルランを使用してください。動物の呼吸が減速し始めると、実験を開始することができます、とノーズコーンは削除して閉じる必要があります。
追加の麻酔が実験のいずれかの部分全体に必要な場合は、追加のペントバルビタールを注射したり、イソフルラン投与することができる。イソフルラン投与の代替の方法が利用可能であり、更新されたガイドラインrecomm可能であれば、麻酔のよりよい制御を可能にするために精度の気化器の使用を終了する。しかし、マウスの呼吸生理学への細心の注意がこれらのいずれかの方法で保証されなければならない。
2。実験を偽骨折。
擬似骨折は、損傷した筋肉に骨の溶液注入が続くと後肢に二国間で行われる軟部組織損傷の組み合わせです。レシピエントマウスのいずれかの実験的操作を開始する前に、骨の溶液を調製する必要があります。
3。骨の溶液の調製。
1つのドナーマウスから調製した骨のソリューションは、3つのレシピエントマウスには十分でしょう。同系ドナーマウスは、年齢と受信者の実験マウスに体重をマッチさせたつまり使用する必要があります。
ドナーマウスは、吸入イソフルランで安楽死されます。ドナーは、下肢は足の先端にテープに細心の注意とプレキシガラスの板にテープで固定されます。下肢は慎重に坊主になると徹底的にbetadineでカバーし、不妊のためのアルコールで拭いている必要があります。その後、大腿骨と脛骨を外科的に両下肢から無菌的に削除されます。下肢からの長い骨を削除するには、鼠径部の皮膚に皮膚切開を行い、ダウン足首に、四肢の長さに沿って皮膚をカットし続ける。皮膚を収納し、露出を最大限化する内側と外側側面に、両方の皮下筋膜と筋肉から離れて分析する。前方および脛骨外側に位置する筋肉（前脛骨筋、指伸筋屈筋、伸筋hallicusの筋、長腓骨、短腓骨筋）の下にはさみの一つのブレードを挿入し、きれいに離れてからの筋肉を持ち上げるために近位と遠位に刃をスライドさせ骨の基礎となる。脛骨（腓腹筋、ヒラメ筋、足底、後脛骨筋、浅指屈筋、屈筋hallicus屈筋）の下の筋肉を分離するために脛骨の後方と内側下面にこのテクニックを繰り返します。遠位に挿入する際には、最小限の追加の労作は、離れて脛骨から腓骨をスナップするために、後方側に使用する必要があります。これらの足の筋肉は、可能な限りそれらの挿入が近くに腱を切断し、遠位の筋肉を縮めるの近位端に、下向きのファッションで一緒に筋肉のグループで小さなタグボートを引っ張っている間は、足関節からこれらの筋肉の遠位の添付ファイルを解放します。足関節は、はさみで直接カットスルーすることができます。この時点で、大腿骨から脛骨を切断しないでください！この接続は、股関節から大腿骨の解剖で助けとなる追加のレバレッジを与えます。大腿骨から筋肉のリリースのための同様の手法に従い、必要に応じても、両方の内側と外側の後方を実行し、。膝関節からそれらを解放するためにこれらの筋肉群の遠位の添付ファイルをカット。解剖を継続して股関節の大腿骨の端を分析するために筋肉の下に従ってください。この解剖を支援するために、皮膚の切開は、はるかに適切な露出を実現するために、必要に応じて拡張されるべきである。股関節における大腿骨の動きは、解剖時の大腿骨の近位端を見つけることができます。
一度大腿骨は、（添付脛骨付）ドナーマウスは無菌4x4gauze上に配置から削除されます。つのボーンは、単に別々の手でそれぞれの骨をつかみ、ゆっくりとその長軸に沿って反対方向に2つの骨がねじれ/回転させることによって膝関節で分離することができます。それらを簡単に手動操作のいずれかの過剰運動で骨折することができるように穏やかな解剖とこれら二つの骨の処理が推奨されます。長骨から残りの腱の添付ファイルを削除するには、骨の長さに巻き4x4のガーゼの乾燥滅菌ピースを使用してください。彼らはガーゼに付着すると骨から外れて迅速かつ容易になるように骨にしっかりとこのガーゼを把握することを骨に数回の完全な長さを引く、これは骨の表面から残りの組織を削るだろう。収集された骨は、その後、滅菌1.5mlの微量遠心管に直接配置し、輸送のために氷の上に配置する必要があります。
これら4つのドナーの骨は、骨のソリューションのための準備のための生物学的安全キャビネットに取得されます。フードは使用前に徹底的に消毒しなければならない、フード内の作業領域の上にドレッシング滅菌フィールドを配置します。作業領域で緩衝生理食塩水（PBS）滅菌乳鉢と乳棒、滅菌8mLチューブと滅菌リン酸を置きます。 1mLのpipetteman、およびそれぞれのヒントは、フード内で利用可能になります。
鉗子の滅菌ペアは、1.5mlのマイクロ遠心チューブから滅菌方法で収穫された骨を除去するために使用し、乳鉢に配置する必要があります。乳棒はゆっくり骨を粉砕するために使用されます。 Phosph食べた緩衝食塩水が注射のための骨片を再懸濁するために使用される車両です。 PBSのピペット1mLの乳鉢にと完全な再懸濁を確保するために追加の円を描くように、残りのフラグメントを粉砕し続ける。その後、PBSの別の1mLのを追加し、"骨のソリューション"を作成するために破砕続ける。解決策は、ピンクの色相を持っているはず、と完全に分割することができるモルタルの下部に、左の残党が存在します。大きな残骸がモルタルの背後に残って確保しながら、ゆっくりと、最大音量をキャッチするために、8mL管にモルタルのソリューションを注ぐ。この骨のソリューションは、実験的に使用するまで氷上に残る必要があり、注射用1mLの注射器に転送されます。 twentyゲージの針は、後でマウスにそれを管理するために骨のソリューションを含む1mLの注射器に添付されます。この大きな針のサイズは、すべての骨片は射出時に地域を入力し、針をブロックしないことを保証するために選ばれました。
レシピエントマウスに注入する前に、骨の溶液の液滴を培養するためのマッコンキー寒天プレート（24 - 48時間のインキュベーション）に配置されます。これは、骨液の無菌性を確保することである。骨の溶液のpHは、中性pHを確かめる必要があります。
4。軟部組織損傷。
この軟部組織損傷は、二国間の後肢の圧挫です。後肢わずかに拉致され、横方向に回転させると、マウスの初期位置は、、適切な筋肉群、膝の屈筋（大腿二頭筋、半腱様筋と半膜様筋）へのアクセシビリティにも役立ちます。大18センチメートル止血剤は、圧挫を実行するために使用されます。これらの応用の止血の力の分布を分析し、止血剤が大腿骨に直面し、その凸の曲線と、大腿骨に沿って大腿後部の筋肉組織、中間点の周りにクランプされている必要がありますセンサープロダクツ社がTopaq圧力解析システムを用いて270psiであることが判明した。止血剤は、最初のクリックのみにシャットダウンロックされ、30秒間残ることがあります。この止血剤の配置に細心の注意を払うことが重要です - それは骨折でないことを確認するために、大腿骨を介してクランプしてはいけません。これは、マウスとの間の再現性の傷害を保証するたびに一貫した方法で実行する必要がありますされています。この圧挫は、両下肢で実行されます。
5。骨の溶液注入。
受信者の実験マウスを麻酔し、前述のように調製される、と前にこの骨インジェクションの軟部組織損傷を受けているでしょう。
骨の溶液は、次いで両側レシピエントマウスの粉砕腿部の筋肉組織に注入されます。 20ゲージの針を使用して、このソリューションの0.15mLをそれぞれの大腿の後部筋に注入されます。皮膚を通して約2〜3ミリメートルの注射針を入力し、針の挿入の距離に注意を払う - ベベルの先端がちょうど大腿骨に対して触れるように感じるだろう、この位置が理想的です。今骨のソリューションを注入。針を撤回し、速やかに傷口のうち骨のソリューションのいずれかの逆流を止めるために注射部位を介して滅菌手袋をはめた指を置きます。数秒のためにそこにこの指を保持する。
マウスはその後、ケージに戻し入れと直接麻酔がおさまるような動きの完全な自由を許可されます。マウスが覚めたように、適切な疼痛管理が投与されている必要があります。
6。 Post-operative/recovery期間。
緩いループテープが削除され、動物は、数時間の後の回復のために循環加熱パッド上に保持されクリーンなケージに入れられます。必要に応じて適切な暖かさは、追加の熱ランプで確保すべきである。
食料と水は容易に利用できるようになります。
動物は正しく痛みを管理するために、麻酔から起こさ始めると鎮痛剤が投与されている必要があります。ブプレノルフィンは、動物が身体活動を始めると（0.1mg/kg）を皮下注射され、前ではなく、そのような呼吸機能を損なわないように。
マウスは常に麻酔または実験的なエンドポイントから回復するまで、麻酔中に監視する必要があります。マウスはまた、非常に慎重に術後の期間に監視することができる必要があり、必要に応じて必要な追加の鎮痛薬を投与すべきである。動物の身体活動、呼吸状態、食料や水の摂取量を監視し、苦痛の兆候（呼吸こじつけの、苦痛、習慣を食べると飲むの変化は）それに応じて対処する必要があります。
70％のアルコールにあなたの手術器具を配置し、滅菌ガーゼでふいてくださいその後、動物の間の殺菌のために〜20秒間マイクロビーズ滅菌器に入れます。手術器具を取り外し、それらを冷やすために70％アルコールでそれらをスプレー。 STにそれらを配置erileフィールドドレッシング。次の動物に戻ってドリップされる楽器に残っているアルコールがないことを確認してください。
3。比較二国間大腿骨骨折モデル - 実験手順：
実験的なマウスを麻酔し、最初に説明したように調製される。大18センチメートル止血剤は、約2〜3ミリメートル膝に直面して凸面を膝関節の上記の後肢の周りにクランプする必要があります。止血剤と腰の間にクランプされた止血剤と人差し指の上に親指を置きます。あなたが破壊されている場所あなたが知っているので、ねじれ前に大腿骨を感じるようにしてください。その後は、もう一方の手を時計回りにねじりながら、反時計回りに止血剤をねじる。
対側の脚で手順を繰り返します。
4。多発外傷モデル - 出血性ショックと偽骨折の組合せのための実験手順：
レシピエントマウスを麻酔し、最初に説明したように調製される。擬似骨折との組み合わせで出血性ショックを受けることであるマウスは、偽骨折手続きの前に大腿動脈カニュレーションを持つことになりますし、擬似骨折が完了した後にこのカテーテルからhemorrhagedされます。
5。成功の秘密：
一般：
- あなたが、できるだけ無菌のままに余分な労力がかかることを確認してください。
- 細心の注意は、麻酔の投与中に、呼吸数を含めて、マウスの全体的な生理的条件に支払われ、ノーズコーンを介して、特にイソフルランされるべきである。
骨の溶液の調製：
- 骨の穏やかな操作 - として簡単に、単純なマニュアル操作時のオーバー労作で破砕することができます！
- 脛骨から腓骨の除去は、解剖時に確保すべきである。
- 最初はゆっくりと骨を粉砕することから始めます - モルタル内のすべてのフラグメントを保つように！
- 当初は1 mLのPBSを追加し、一度良いサスペンションが形成され、残りの骨片を破砕、引き続き残りの1mlを加える。
- 乳鉢と乳棒から唯一の解決策は、収集されるべきである - 完全に分けることができなかった大規模な残りの組織なし - これらのことは、ブロックされる可能性があります/レシピエントマウスに注射すると針に引っかかる。
軟部組織損傷：
- ない大腿骨を介して、またはそれが破断される - この止血剤の注意深い配置は重要です。再現性の傷害のための - 正しい筋肉（膝屈筋大腿後部）を介して止血クランプ。
骨の溶液注入：
- 液を注入する際、針の挿入の距離のアテンション支払う - ベベルの先端がちょうど大腿骨に対して触れるように感じるだろう、この位置が理想的です。
- 針を撤回し、速やかに傷口のうち骨のソリューションのいずれかの逆流を止めるために注射部位上で指を置きます。数秒のためにそこに指を保持する。
6。手術懸念を投稿：
- 足の感染を確認してください。
- 骨のソリューションの文化を確認してください。
- 動物は、実験的操作と関連する炎症の結果として、後肢を使って問題がある可能性があります。適切な痛みを管理する。
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Discussion
偽骨折、無菌筋骨格系の外傷の再現性のマウスモデルでは、外傷後の免疫応答の評価することができます。偽骨折モデルは、免疫学的に長骨の骨折の特徴のレクリエーションを通じて四肢の骨折の環境を模倣しています：傷ついた筋肉や軟組織が ネイティブ骨を壊すことなく、損傷した骨や骨髄にさらされている38,39二相性の免疫応答は、以下の見ることができます。 48時間前後トラフとして描か遅延免疫抑制の第二成分が続く6時間でピークに見られる初期のhyperinflammatory応答で構成されて偽骨折の外傷。このモデルは複雑で、簡単に再現できないことができるような骨折固定などの実験的マウス外傷のモデリングの課題のいくつかを克服するのに役立ちます。それはネイティブの骨の骨折することなく、動物での長期生存を可能にするため、特にこのモデルは、心的外傷後の免疫応答の後期長期研究を可能にします。
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Disclosures
動物実験は動物実験によって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行われ、ピッツバーグ大学、AALAS / AAALAC認定機関の委員会と研究の行動規範とコンプライアンスオフィスを使用していた。動物の源は、ジャクソン研究所とチャールズ川の研究所などがあります。すべての動物が豊富な健康上の各ベンダーを通して保証だけでなく、ピッツバーグの内部の動物の健康監視プログラムの大学を受ける。この研究は、脊椎動物、動物の使用に関する米国政府のプリンシパルに準拠して実施しています。プログラムは、USDAに登録され、実験動物の福祉の公衆衛生サービス局に保証の手紙を持っています。
Acknowledgments
出血性ショックGM053789の資金源/ナンバー分子生物学
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical blue pad | Fisher Scientific | 50-7105 | |
| Sterile Field dressings | Fisher Scientific | NC9517505 | |
| Circulating heating pad 18"x26" | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Hot bead instrument sterilizer | VWR international | 11156-002 | |
| Stainless steel tray 8" x 11" | VWR international | 62687-049 | |
| Plexiglass boards (10x15x0.5cm) | University of Pittsburgh Machine shop | ||
| Tape rolls 1" | Corporate Express | MMM26001 | |
| 50cc conical tube | Any Supplier | ||
| Straight side wide mouth jars (used as cap for nose cone) | VWR international | 159000-058 | |
| Oster A5 clippers w. size 40 blade | VWR international | 10749-020 | |
| Surgical scissors (straight – 12cm) | Fine Science Tools | 14068-12 | |
| Hemostats curved -18cm | Harvard Apparatus | 81331718 | |
| Forceps (0.8mm-tip, curved-10cm) | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Gauze 4"x4" | Any Supplier | ||
| 1.5cc microfuge tube | Any Supplier | ||
| Ice bucket | Any Supplier | ||
| Mortar and Pestle | Fisher Scientific | 12-961AA | |
| 1cc syringe w/ 25G needle | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| 20G needle | Any Supplier | ||
| 1mL pipetteman | Any Supplier | ||
| 1mL pipette tips | Any Supplier | ||
| Falcon polystyrene 8ml tubes | VWR international | 60819-331 | |
| Sterilization pouch 3"x8" | VWR international | 24008 | |
| Sterilization pouch 5"x10" | VWR international | 24010 | |
| MacConkey II Agar plate | BD Biosciences | 221172 | |
| Ethyl Alcohol - 200 proof | Pharmco-AAPER | [70%] | |
| Pentobarbital Sodium (Nembutol Sodium Solution) | OVATION Pharmaceuticals | 70mg/kg | |
| Aerrane (Isoflurane) | Baxter Internationl Inc. | 99.9% | |
| Triadine Povidone Iodine (Betadine) | Triad disposables | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| Buprenorphine HCl | Bedford Laboratories | 0.1mg/kg |
References
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