Summary
आदेश में Bicyclus anynana pupal पंख ऊतक में जीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए, हम के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल सीटू riboprobes का उपयोग hybridizations में मौजूद है. हम भी अन्य Lepidopteran प्रजातियों के pupal पंखों में इस्तेमाल के लिए इस प्रोटोकॉल के आगे अनुकूलन के लिए दिशा निर्देश प्रदान करते हैं.
Abstract
यहाँ हम वीडियो प्रारूप में मौजूद है,, तितली Bicyclus anynana के pupal पंख riboprobes का उपयोग में सीटू hybridizations के लिए एक प्रोटोकॉल है. सीटू hybridizations में, विकास जीव विज्ञान के एक मुख्य आधार, प्रतिलेखन के स्तर पर ऊतकों के विकास में जीन अभिव्यक्ति के स्थानिक और लौकिक पैटर्न के अध्ययन के लिए उपयोगी होते हैं. यदि एंटीबॉडी कि लक्ष्य जीन प्रतिलेखन के प्रोटीन उत्पादों अभी तक विकसित नहीं किया गया है, और / या जीनोम है कि एंटीबॉडी का उपयोग उपलब्ध फर्क नहीं कर सकते में एक विशेष प्रोटीन के एकाधिक जीन प्रतियां हैं, बजाय situs में इस्तेमाल किया जा सकता है. जबकि लार्वा विंग डिस्क के लिए सीटू तकनीक में एक तितली समुदाय के लिए उपलब्ध कई वर्षों के लिए किया गया है, वर्तमान प्रोटोकॉल बड़ा और अधिक नाजुक pupal पंखों के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है.
Protocol
1 दिन
- निम्न समाधानों को तैयार:
- 10x पीबीएस
- 1x पीबीएस
- 1x पीबीटी
- DDH 2 हे
- 0.1% की कुल मात्रा के लिए DEPC जोड़ें और समाधान सख्ती से हिला.
- आटोक्लेव.
- 4% Paraformaldehyde फिक्स - पीबीएस - DEPC का उपयोग
- सख्ती विभाज्य हटाने से पहले अगर वेग मौजूद है, भंवर - proteinase कश्मीर समाधान
- पाचन स्टॉप बफर
- Prehybridization बफर
- 50:50 पीबीटी Prehybridization बफर:
- संकरण बफर
- समाधान RNase मुक्त रखा जाना चाहिए. या तो कांच के बर्तन कि बेक्ड किया गया है (4 घंटे 250 ° सी) या डिस्पोजेबल प्लास्टिक का उपयोग करें. सीरम विज्ञानी pipettes समाधान बनाने के लिए बहुत उपयोगी हैं
- से पंख काटना समय का मंचन किया - पीबीएस में pupae
- पंख सीधे स्थानांतरित करने के लिए 24 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली के कुओं में कमरे के तापमान पर बफर फिक्स
- 2 घंटे के लिए डिस्क फिक्स
- पीबीटी में धो 5 x 5 मिनट
- Proteinase कश्मीर समाधान में 3 मिनट के लिए पंख सेते
- पाचन स्टॉप बफर में 2 एक्स कुल्ला
- पीबीटी में धो 5 x 5 मिनट
- 50:50 पीबीटी में 2 x 5 मिनट धो: PHB
- PHB में धो 1 एक्स 10 मिनट
- 55 में PHB कम से कम 1 घंटे में सेते डिग्री सेल्सियस
- हीट - denature शाही सेना जांच (20-50ng अच्छी तरह से प्रति आवश्यक) (80 ° 5 मिनट के लिए सी) और संकरण बफर (100 μl अच्छी तरह से प्रति जरूरत) को जोड़ने
- कुओं जांच जोड़ें और 55 में 48 घंटे सेते डिग्री सेल्सियस
3 दिन
- 55 में धो 4 एक्स 5 मिनट डिग्री सेल्सियस PHB
- 55 में PHB में रातोंरात सेते ° सी
4 दिन
- निम्न समाधानों को तैयार:
- एंटीबॉडी ब्लॉक बफर
- PHB: 50:50 पीबीटी में 1 x 5 मिनट धो
- पीबीटी में धो 4 एक्स 5 मिनट
- 4 ब्लॉक बफर में 1 घंटे के लिए सेते पंख डिग्री सेल्सियस
- विरोधी खोदो एंटीबॉडी के 1:2000 4 में रातोंरात कमजोर पड़ने में पंख सेते ° सी
5 दिन
- निम्न समाधानों को तैयार:
- जांच बफर
- विकासशील समाधान - संवेदनशील प्रकाश (पन्नी में लपेटो)
- कमरे के तापमान पर धो पीबीटी में 3 एक्स 5 मिनट
- धो पीबीटी में 7 x 5 मिनट
- पंख जांच बफर में दो बार कुल्ला
- विकास समाधान के 1 मिलीलीटर में पंखों का विकास - विकास के समय हर बार निगरानी की जानी चाहिए विकासशील बार भी बदल जब एक ही जांच और विकासशील समाधान का उपयोग कर सकते हैं - आम तौर पर 5-10 मिनट के बाद जांच और तब अंतराल रातोंरात वृद्धि. प्लेट पन्नी में लिपटे होना चाहिए प्रकाश प्रदर्शन को रोकने के जब नमूनों की जाँच नहीं है.
- विकास स्टॉप बफर में पांच बार कुल्ला
- पंख माउंट.
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Discussion
मौजूदा प्रोटोकॉल का अनुकूलन
लार्वा विंग डिस्क पर सीटू hybridizations में सफलतापूर्वक किया गया है संक्षिप्त coenia तितलियों से डिस्क का उपयोग किया (कैरोल एट अल 1994, कुंजी एट अल 1999, Weatherbee एट अल 1999). वर्तमान प्रोटोकॉल कैरोल लैब से लार्वा विंग stainings के लिए अनुरोध पर एक विस्तृत लिखित उपलब्ध प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया है. हम परिवर्तन की सेवा लार्वा और pupal विंग ऊतकों के बीच मतभेदों को समायोजित. Pupal hindwing dissections के दौरान, peripodial झिल्ली और हटाया जाना चाहिए कुओं में शामिल नहीं है. प्रारंभिक तय समय हमारे प्रोटोकॉल में बहुत लंबे समय तक है, लेकिन बाद तय कदम हटा दिया गया है. हमने पाया है कि proteinase कश्मीर समाधान के एक 10 गुना कमजोर पड़ने नाजुक pupal विंग जबकि अभी भी सफल जांच पैठ के लिए अनुमति देता है ऊतक के लिए आवश्यक था. हम यह भी पाया कि पंख अवरुद्ध पहले एंटीबॉडी धुंधला पृष्ठभूमि बहुत कम है, रात भर के लिए 4 में एंटीबॉडी ऊष्मायन बढ़ रही है जबकि डिग्री सेल्सियस सिग्नल की शक्ति में वृद्धि हुई.
अनुप्रयोगों
इस प्रोटोकॉल के अनुप्रयोगों को कई गुना कर रहे हैं. एक विकासशील pupal पंख पर एक उम्मीदवार जीन की अभिव्यक्ति का स्थानीयकरण करने में सक्षम होने के नाते विंग विंग या पैटर्न के विकास के दौरान कुछ कार्यात्मक भूमिका में इस जीन implicating में पहला कदम हो सकता है (मार्कस एट अल 2004. रामोस एट अल 2006) होगा. यदि कई जीन है कि अन्य प्रणालियों में बातचीत के लिए जाना जाता है पंख पर एक साथ सह व्यक्त इस उपन्यास पंख पैटर्न निर्दिष्ट में अधिक विस्तृत जीन नेटवर्क के सह - विकल्प फंसाना (मोंटीरो एट अल 2006). तितली पंख पैटर्न evo-देवो एक अमीर प्रणाली जहां उचित evo देवो सवालों जीन और जीन नेटवर्क सह - विकल्प, सस्ता माल के विकास, संसृत और समानांतर लक्षण के विकास, धारावाहिक समरूपता के विकास और जीन की प्रक्रिया को शामिल प्रदान करता है दोहराव और उप functionalization सब एक एकीकृत फैशन में अध्ययन किया जा सकता है. इसके अलावा, तितलियों के पंख पैटर्न है कि प्रजातियों की पहचान, यौन चयन, अनुकरण, तापमान, और शिकारी परिहार में एक भूमिका निभा की एक bewildering विविधता प्रदर्शित करते हैं. इन नमूनों की पीढ़ी के पीछे दोनों आनुवंशिक और विकास के आधार के रूप में अच्छी तरह से पारिस्थितिकी कारकों है कि कुछ निश्चित पैटर्न पक्ष को समझना हमारे विकासवादी प्रक्रिया का और विकास सिस्टम के द्वारा इस प्रक्रिया पर लगाया biases और बाधाओं के एक समग्र समझ में ला सकते हैं.
विभिन्न प्रजातियों के अनुकूलन के लिए अनुकूलन दिशा - निर्देश
जब अलग अलग प्रजातियों के पंखों को इस प्रोटोकॉल अनुकूल है, मुख्य चिंता जांच करने के लिए ऊतक पारगम्य जबकि ऊतक की अखंडता को बनाए रखने कर रही हो जाएगा. इसलिए, निर्धारण और permeablization कदम के लिए अनुकूलित किया जाना होगा. Bicyclus pupal पंखों के लिए, हमने पाया है कि ताजा पीएफए बफर और एक कोमल proteinase कश्मीर पाचन में एक कमरे के तापमान पर 2 घंटे तय के लिए पर्याप्त है. ऊतकों 12 घंटे के लिए तय हो सकता है 4 डिग्री सेल्सियस यदि आवश्यक है, लेकिन यह तय ऊतक जो संकेत कम हो जाएगा संभव है, इतनी कम निर्धारण बार पसंद कर रहे हैं. दोनों एंजाइम एकाग्रता और और पाचन की लंबाई के तापमान प्रत्येक ऊतक के लिए empirically निर्धारित करना चाहिए. पंखों की उम्र भी digestions में एक महत्वपूर्ण कारक हो सकता है बड़े पंख के रूप में अधिक विस्तृत cuticular संरचनाओं और अस्वीकार एक लंबे समय तक पाचन की आवश्यकता होगी. यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि proteinase कश्मीर तैयारी है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कर रहे हैं एक विशिष्ट गतिविधि के लिए मानकीकृत नहीं हैं, इसलिए है, पाचन की स्थिति भी जब बहुत बदल रहा है समायोजित किया जा आवश्यकता हो सकती है. ऊतकों की पारगम्यता भी डिटर्जेंट समाधान में ऊष्मायन द्वारा कर सकते हैं वृद्धि की जानी है, उदाहरण के लिए एक 1% समाधान ट्राइटन एक्स. यह prehybridization कदम से पहले जोड़ा जा सकता है.
एक और चिंता का विषय जांच आकार का अनुकूलन किया जाएगा, अंगूठे के सामान्य नियम बड़ा किया जा रहा है बेहतर है. बॉब रीड, जो situs में Heliconius में देर pupal पंख प्रदर्शन किया है एक लक्ष्य आकार (निजी संचार) के रूप में 300 बीपी का सुझाव दिया. बड़ी जांच है, जो संकेत की विशिष्टता वृद्धि हो सकती है, कोशिकाओं में उनके प्रवेश सहायता hydrolyzed हो सकता है. अन्य प्रणालियों में, तथापि, शोधकर्ताओं ने नियमित रूप से उन्हें hydrolyzing के बिना 1 केबी जांच का उपयोग. यहाँ हम 300bp के रूप में अच्छी तरह से जो ठीक काम के आसपास जांच इस्तेमाल किया.
Riboprobes के साथ कार्य से निपटने शाही सेना के लिए इस्तेमाल किया नहीं प्रयोगशालाओं के लिए डराना किया जा सकता. हम काफी मजबूत हो सकता है और करने के लिए कई कदम है कि RNase गतिविधि के कारण जांच के नुकसान को कम से कम होते हैं इस तकनीक में पाया गया है. Proteinase कश्मीर पाचन RNase संदूषण को निकालने और prehybridization / संकरण बफ़र्स के 50% formamide RNase गतिविधि को बाधित (1992 Chomczynski). इसलिए, हम लोगों को riboprobes जो संकेत की विशिष्टता को बढ़ाने का उपयोग करने के लिए प्रोत्साहित करते हैं और के रूप में के रूप में कुछ लगता है कि हो सकता है चुनौतीपूर्ण नहीं कर रहे हैं.
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Acknowledgments
हम Jayne Selegue, मार्गरेट Hollingsworth, जिन बेरी, Ryo Futahashi, Najmus सहार Mahfooz, Aleksandar Popadic, बॉब रीड, Roche इस प्रोटोकॉल की समस्या निवारण में मदद के लिए तकनीकी सहायता धन्यवाद. हम यह भी सलाह के लिए फिल्म संपादन पर विलियम PIEL धन्यवाद.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5mg/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | C0612 | Mounting Medium |
References
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52 (2006).
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- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
