Summary
Con el fin de examinar la expresión de genes en el tejido del ala pupal de Bicyclus anynana, presentamos un protocolo optimizado para hibridaciones in situ utilizando riboprobes. También proporcionar directrices para la optimización de este protocolo para su uso en las alas de las especies de lepidópteros pupal otros.
Abstract
Aquí presentamos, en formato de vídeo, un protocolo para hibridaciones in situ en las alas de la crisálida de mariposa anynana Bicyclus con riboprobes. Hibridaciones in situ, uno de los pilares de la biología del desarrollo, son útiles para estudiar los patrones espaciales y temporales de la expresión génica en el desarrollo de los tejidos a nivel de la transcripción. Si los anticuerpos que se dirigen los productos de proteína de la transcripción de genes todavía no se han desarrollado, y / o hay varias copias del gen de una proteína en el genoma que no se puede diferenciar el uso de anticuerpos disponibles, en situs se puede utilizar en su lugar. Mientras que una técnica in situ para los discos de ala larval ha estado disponible para la comunidad de mariposas durante varios años, el actual protocolo ha sido optimizado para las alas más grandes y más frágiles de pupa.
Protocol
DIA 1
- Prepare las siguientes soluciones:
- 10x PBS
- 1x PBS
- 1x PBT
- ddH2O
- Añadir DEPC 0,1% de volumen total y agitar vigorosamente soluciones.
- Autoclave.
- Paraformaldehído al 4% Fix - con PBS-DEPC
- Proteinasa K solución - si precipitado se presente y agitar vigorosamente antes de retirar alícuota
- Detener la digestión Buffer
- Prehibridación Buffer
- 50:50 PBT: Buffer de prehibridación
- La hibridación de búfer
- Las soluciones deben mantenerse libres de RNasa. Uso ya sea de vidrio-ware que se ha cocido (4 horas a 250 ° C) o de plástico desechable. Pipetas serológicas son muy útiles para la confección de soluciones
- Diseccionar las alas de vez en escena pupas en PBS
- Mover las alas directamente a Fix de búfer en pozos de 24 de placa de cultivo bien a temperatura ambiente
- Fix discos durante 2 horas
- Lavado de 5 x 5 minutos en PBT
- Incubar las alas durante 3 minutos en solución de proteinasa K
- Enjuague 2 x en tampón de digestión Detener
- Lavado de 5 x 5 minutos en PBT
- Lavado de 2 x 5 minutos en 50:50 PBT: PHB
- Lavado de 1 x 10 minutos en PHB
- Incubar en PHB por lo menos 1 hora a 55 ° C.
- El calor desnaturaliza sonda de ARN (20-50ng necesario por tanto) (80 ° C durante 5 minutos) y añadir al tampón de hibridación (100 l que se necesita por tanto)
- Añadir la sonda a los pozos y se incuba 48 horas a 55 ° C
DÍA 3
- Lavar 4 x 5 minutos en 55 ° C PHB
- Incubar toda la noche en el PHB a 55 ° C
DIA 4
- Prepare las siguientes soluciones:
- Anticuerpos buffer de bloque
- Lavado de 1 x 5 minutos en 50:50 PBT: PHB
- Lavar 4 x 5 minutos en PBT
- Alas de incubar durante 1 hora en tampón de bloque a 4 ° C
- Incubar las alas en una dilución 1:2000 de anticuerpos anti-Cavar la noche a 4 ° C
DIA 5
- Prepare las siguientes soluciones:
- Detección de Buffer
- Solución en desarrollo - (envolver en papel de aluminio) sensible a la luz
- Lavar 3 x 5 minutos en PBT a temperatura ambiente
- Lavado de 7 x 5 minutos en PBT
- Enjuague alas dos veces en tampón de detección
- Desarrollar alas en 1 ml de solución de desarrollo - el tiempo de desarrollo deben ser controlados cada vez que - el tiempo de programación puede cambiar, incluso cuando se utilizan las mismas sondas y la solución de desarrollo - en general, verificación después de 5-10 minutos y luego aumentar los intervalos durante toda la noche. Placa debe ser envuelto en papel de aluminio para evitar exposición a la luz cuando no la comprobación de muestras.
- Enjuague cinco veces en el tampón de detener el desarrollo de
- Montar las alas.
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Discussion
Optimización de los protocolos existentes
Hibridaciones in situ en los discos de ala larvas se han realizado exitosamente usando discos de Precis mariposas coenia (Carroll et al 1994;. Keys et al 1999;. Weatherbee et al 1999).. El actual protocolo ha sido adaptado de un protocolo escrito detallado disponible a petición del Laboratorio de Carroll para tinciones alas larvas. Los cambios que hemos hecho servir para dar cabida a las diferencias entre los tejidos del ala de larva y pupa. Durante pupal disecciones alas posteriores, la membrana peripodial deben ser retirados y no se incluyeron en los pozos. El tiempo fijo inicial es mucho mayor en el protocolo, pero el paso posterior a la corrección ha sido eliminado. Hemos encontrado que una dilución de 10 veces de la solución de proteinasa K era necesario que el tejido frágil ala pupal al tiempo que permite la penetración de la sonda con éxito. También se encontró que el bloqueo de las alas antes de la tinción de anticuerpos reducido en gran medida de fondo, mientras que el aumento de la incubación del anticuerpo de la noche a 4 ° C el aumento de intensidad de señal.
Aplicaciones
Las aplicaciones de este protocolo son múltiples. Ser capaz de localizar la expresión de un gen candidato de un ala en desarrollo pupal será el primer paso que implica este gen en un papel funcional durante el desarrollo del modelo de ala o ala (Marcus et al 2004;. Ramos et al 2006).. Si varios genes que se sabe que interactúan en otros sistemas son co-expresados conjuntamente en las alas que esto puede implicar a la cooptación de las redes de genes más elaborada en la especificación de nuevos patrones de mariposa (Monteiro et al. 2006). Ala de la mariposa patrón de evo-devo ofrece un sistema rico en lo pertinente evo-devo cuestiones referentes a los procesos de la genética y la red de genes co-opción, la evolución de las novedades, la evolución de rasgos convergentes y paralelos, la evolución de la homología de serie, y de genes la duplicación y la sub-funcionalización de todos puede ser estudiado de una manera integrada. Por otra parte, las mariposas muestran una desconcertante variedad de patrones de ala que juegan un papel en el reconocimiento de las especies, la selección sexual, la mímica, la termorregulación, y evitar a los depredadores. El entendimiento de las bases genéticas y de desarrollo detrás de la generación de estos modelos, así como los factores ecológicos que favorecen a ciertos patrones nos puede llevar a una comprensión integral del proceso evolutivo y de los prejuicios y las limitaciones impuestas a este proceso por los sistemas de desarrollo.
Las directrices de optimización para la adaptación a las diferentes especies
Al adaptar este protocolo para las alas de las diferentes especies, la principal preocupación será hacer que el tejido permeable a la sonda mientras se mantiene la integridad del tejido. Por lo tanto, los pasos de fijación y permeablization tendrá que ser optimizada. Para Bicyclus alas pupal, hemos encontrado que una solución 2 horas a temperatura ambiente en tampón fresco PFA y una digestión de proteinasa K suave es suficiente. Los tejidos pueden ser fijos hasta 12 horas a 4 ° C si es necesario, pero es posible a un exceso de tejido arreglar lo que reducirá la señal, por lo que la fijación de tiempos más cortos son los preferidos. Tanto la concentración de la enzima y de la duración y la temperatura de la digestión debe ser determinada empíricamente para cada tejido. La edad de las alas también puede ser un factor importante en la digestión como mayores alas tienen estructuras cuticulares más elaborado y más aún han de ser usados por más tiempo. Es importante recordar que los preparados de proteinasa K que están disponibles comercialmente no están estandarizados para una actividad específica y, por tanto, las condiciones de digestión también puede ser necesario ajustar cuando se cambia un montón. La permeabilidad de los tejidos también se puede aumentar mediante la incubación en las soluciones de detergente, por ejemplo, un 1% de Triton X-solución. Esto podría ser añadido antes de la etapa de prehibridación.
Otra preocupación será la de optimizar el tamaño de la sonda, regla general que cuanto más grande mejor. Bob Reed, que ha realizado el ala pupal tarde en situs en Heliconius, sugerido de 300 pb en un tamaño de destino (comunicación personal). Mayor sondas, lo que puede aumentar la especificidad de la señal, puede ser hidrolizado para ayudar a su entrada en las células. En otros sistemas, sin embargo, los investigadores utilizan habitualmente una sonda kb sin hidrolizar ellos. Aquí utilizamos sondas alrededor de 300bp, así que trabajó muy bien.
Trabajar con riboprobes puede ser intimidante para los laboratorios no se utilizan para la manipulación de ARN. Hemos encontrado que esta técnica es bastante robusto y que contiene varias medidas que reduzcan al mínimo la pérdida de la sonda debido a la actividad RNasa. La digestión de proteinasa K elimina la contaminación y la RNasa formamida 50% de los buffers de prehibridación / hibridación inhiben la actividad de RNasa (Chomczynski 1992). Por lo tanto, animamos a la gente a usar riboprobes que aumentan la especificidad de la señal y no es tan desalentador como algunos pueden pensar.
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Acknowledgments
Damos las gracias a Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Berry Jin, Futahashi Ryo, Najmus Sahar Mahfudh, Popadic Aleksandar, Bob Reed, de apoyo técnico para ayudar a Roche en la solución de este protocolo. También queremos agradecer a William Piel para el consejo sobre la edición de la película.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5mg/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | C0612 | Mounting Medium |
References
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52 (2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55 (2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
