Summary
من أجل دراسة التعبير الجيني في أنسجة الجناح العذراء من anynana Bicyclus ، نقدم بروتوكول الأمثل لفي الموقع التهجين باستخدام riboprobes. كما نقوم بتوفير مبادئ توجيهية لمزيد من التحسين على هذا البروتوكول لاستخدامها في أجنحة العذراء الأنواع Lepidopteran الأخرى.
Abstract
هنا نقدم ، في شكل شرائط فيديو ، وبروتوكول لالتهجين في الموقع في أجنحة العذراء من anynana Bicyclus فراشة riboprobes به. التهجين في الموقع ، وهي الدعامة الأساسية لعلم الأحياء التطوري ومفيدة لدراسة الأنماط المكانية والزمانية في التعبير الجيني في أنسجة النامية على مستوى النسخ. إذا الأجسام المضادة التي تستهدف منتجات البروتين من النسخ الجيني لم يتم تطويرها ، و / أو وجود نسخ متعددة من الجينات بروتين معين في الخريطة الوراثية البشرية التي لا يمكن أن تكون متباينة باستخدام الاجسام المضادة المتوفرة ، يمكن أن تستخدم في مكان المال بدلا من ذلك. في حين أن الوضع الطبيعي للتقنية أقراص الجناح اليرقات كانت متاحة للمجتمع فراشة لعدة سنوات ، وقد تم تحسين البروتوكول الحالي لأجنحة العذراء أكبر وأكثر هشاشة.
Protocol
DAY 1
- إعداد الحلول التالية :
- 10X PBS
- 1X PBS
- 1X PBT
- DDH 2 O
- إضافة DEPC عن الحجم الكلي 0.1 ٪ ويهز الحلول بقوة.
- الأوتوكلاف.
- 4 ٪ لامتصاص العرق فيكس -- باستخدام برنامج تلفزيوني ، DEPC
- بروتين K الحل -- إذا كان موجودا متعجل ، دوامة بقوة قبل إزالة قسامة
- الهضم إيقاف مؤقت
- Prehybridization العازلة
- 50:50 PBT : الاحتياطي Prehybridization
- التهجين العازلة
- يجب أن تبقى الحلول ريبونوكلياز خالية. إما استخدام الزجاج وير التي تم خبز (4 ساعات بمعدل 250 درجة مئوية) أو البلاستيكية. ماصات المصلية مفيدة جدا لصنع ما يصل حلول
- تشريح أجنحة من الوقت قام الشرانق في برنامج تلفزيوني
- الانتقال مباشرة إلى الأجنحة إصلاح الاحتياطي في الآبار من 24 لوحة الثقافة جيدا في درجة حرارة الغرفة
- الإصلاح أقراص لمدة 2 ساعة
- يغسل 5 × 5 دقائق في PBT
- احتضان أجنحة لمدة 3 دقائق في محلول K بروتيناز
- شطف 2 x في مخزن إيقاف الهضم
- يغسل 5 × 5 دقائق في PBT
- غسل 2 × 5 دقائق في PBT 50:50 : PHB
- يغسل 1 × 10 دقيقة في PHB
- احتضان في ساعة ما لا يقل عن 1 PHB في 55 درجة مئوية.
- الحرارة تفسد RNA التحقيق (20 50ng اللازمة لكل بئر) (80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق) وإضافة إلى تهجين العازلة (100 ميكرولتر اللازمة لكل بئر)
- إضافة إلى التحقيق الآبار واحتضان 48 ساعة عند 55 درجة مئوية
اليوم 3
- يغسل 4 × 5 دقائق في درجة حرارة 55 مئوية PHB
- بين عشية وضحاها في احتضان PHB عند 55 درجة مئوية
اليوم 4
- إعداد الحلول التالية :
- الأضداد كتلة عازلة
- يغسل 1 × 5 دقائق في PBT 50:50 : PHB
- يغسل 4 × 5 دقائق في PBT
- أجنحة احتضان لمدة 1 ساعة في مخزن في بلوك 4 درجات مئوية
- احتضان أجنحة في التخفيف 1:2000 المضادة للحفر الأضداد بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية
يوم 5
- إعداد الحلول التالية :
- الكشف عن مخزن
- الحل النامية -- (التفاف في احباط) الضوء الحساسة
- تغسل 3 × 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في PBT
- يغسل 7 × 5 دقائق في PBT
- شطف جناحي مرات في الكشف عن مخزن
- تطوير أجنحة في 1 مل من محلول النامية -- يجب مراقبة الوقت للتنمية في كل مرة -- مرة النامية يمكن أن تتغير حتى عند استخدام نفس تحقيقات والحل النامية -- الاختيار عادة بعد 5-10 دقائق ثم زيادة فترات تصل إلى بين عشية وضحاها. وينبغي أن تكون ملفوفة في احباط لوحة لمنع التعرض للضوء عند عدم التحقق من العينات.
- شطف خمس مرات في إيقاف مؤقت النامية
- جبل الأجنحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعظيم الاستفادة من البروتوكولات القائمة
التهجين في الموقع على أقراص الجناح اليرقات أجريت بنجاح باستخدام أقراص من الفراشات coenia نبذة (كارول وآخرون 1994 ؛. كيز وآخرون 1999 ؛. Weatherbee وآخرون 1999). وقد تم تكييف البروتوكول الحالي من بروتوكول الخطية المفصلة متوفرة عند الطلب من مختبر لكارول stainings الجناح اليرقات. التغييرات التي قطعناها على أنفسنا خدمة لاستيعاب الاختلافات بين الأنسجة الجناح اليرقات والعذراء. أثناء تشريح hindwing العذراء ، ينبغي إزالة غشاء peripodial وغير المدرجة في الآبار. الوقت الإصلاح الأولي هو أطول بكثير في بروتوكول لدينا ولكن تمت إزالة هذه الخطوة بعد الإصلاح. وجدنا أن 10 أضعاف التخفيف من الحل K بروتين ضروري لأنسجة الجناح العذراء الهشة في حين لا يزال يسمح لاختراق تحقيق النجاح. وجدنا أيضا أن حظر الأجنحة قبل تلوين الخلفية الضد تقلص إلى حد كبير ، في حين أن زيادة حضانة الضد ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية زيادة قوة الإشارة.
تطبيقات
تطبيقات هذا البروتوكول متعددة. وسوف تكون قادرة على ترجمة التعبير عن الجينات مرشح على جناح العذراء النامية أن تكون الخطوة الأولى في تورط هذا الجين في بعض دور وظيفي أثناء تطوير نمط جناح أو جناح (ماركوس وآخرون 2004 ؛. راموس وآخرون 2006). إذا كانت العديد من الجينات التي هي معروفة للتفاعل في النظم الأخرى المشاركة في أعربت معا على أجنحة هذا قد شارك في توريط خيار وضع أكثر من الشبكات الجينات في تحديد أنماط الجناح رواية (مونتيرو وآخرون 2006). فراشة الجناح نمط ايفو - DEVO يوفر نظام الغنية ذات الصلة حيث ايفو - DEVO المسائل التي تنطوي على عمليات الجينات والجينات الشبكة شارك في الخيار ، وتطور المستجدات ، وتطور الصفات المتقاربة وبالتوازي مع ذلك ، تطور تناظر المسلسل ، والجين يمكن لجميع الازدواجية وشبه functionalization - دراستها بطريقة متكاملة. وعلاوة على ذلك ، والفراشات عرض مجموعة متنوعة من أنماط محيرة الجناح التي تلعب دورا في التعرف على الأنواع ، والانتقاء الجنسي ، المحاكاة ، الحراري ، وتجنب الحيوانات المفترسة. يمكن فهم كل من الأساس الجيني والتنموية وراء جيل من هذه الأنماط ، فضلا عن العوامل البيئية التي صالح أنماط معينة تعيدنا إلى فهم شامل للعملية تطورية وأشكال التحيز والقيود المفروضة على هذه العملية من قبل أنظمة التنموية.
إرشادات التحسين من أجل التكيف مع أنواع مختلفة
عندما تكييف هذا البروتوكول إلى أجنحة من مختلف الأنواع ، وسوف يكون مصدر القلق الرئيسي صنع النسيج نفاذا إلى التحقيق مع الحفاظ على سلامة الأنسجة. ولذلك ، فإن الخطوات تثبيت وpermeablization يتعين الأمثل. للأجنحة Bicyclus العذراء ، وجدنا أن إصلاح 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة العازلة في منهاج جديد وK بروتين الهضم طيف كافية. قد تكون ثابتة الأنسجة تصل إلى 12 ساعة في 4 درجات مئوية إذا لزم الأمر ولكن من الممكن المبالغة في إصلاح الأنسجة والتي سوف تقلل إشارة ، ويفضل التثبيت أقصر الأوقات بذلك. وينبغي أن تحدد كل من تركيز الانزيم وطول ودرجة الحرارة الهضم تجريبيا لكل الأنسجة. قد سن الأجنحة أيضا أن تكون عاملا مهما في الهضم كما أقدم أجنحة سيكون هياكل جليدية أكثر تفصيلا ويحتاج كلا أطول عملية الهضم. من المهم أن نتذكر أن الاستعدادات K بروتيناز المتوفرة تجاريا ليست موحدة لنشاط معين ، وبالتالي ، قد تحتاج أيضا ظروف الهضم إلى أن يتم ضبط عند تغيير الكثير. يمكن أيضا أن تكون نفاذية الأنسجة بنسبة حضانة في حلول المنظفات ، على سبيل المثال (أ) 1 ٪ تريتون - X الحل. ويمكن إضافة هذه الخطوة قبل prehybridization.
قلق آخر سيكون لتحسين حجم التحقيق ، كقاعدة عامة من الإبهام يجري الأكبر هو الأفضل. اقترح بوب ريد ، والذي أجرى في وقت متأخر من الجناح العذراء موقع المال في Heliconius ، و 300 سنة مضت حيث حجم الهدف (اتصال شخصي). أكبر التحقيقات ، والتي قد تزيد من خصوصية للإشارة ، قد تحلل لمساعدة دخولها الخلايا. في النظم الأخرى ، ومع ذلك ، يستخدم الباحثون عادة 1 كيلوبايت تحقيقات دون hydrolyzing لهم. المستخدمة هنا نحن تحقيقات حول 300bp كذلك التي عملت بشكل جيد.
يمكن أن تعمل مع riboprobes يمكن تخويف للمختبرات لم يعتادوا على التعامل مع الحمض النووي الريبي. لقد تم العثور على هذه التقنية لتكون قوية نوعا ما وتحتوي على العديد من الخطوات التي تقلل من الخسائر في التحقيق بسبب النشاط ريبونوكلياز. سوف الهضم K بروتيناز إزالة التلوث وريبونوكلياز formamide 50 ٪ من مخازن prehybridization / تهجين سوف تمنع نشاط ريبونوكلياز (Chomczynski 1992). ولذلك ، فإننا نشجع الناس على استخدام riboprobes التي تزيد من خصوصية للإشارة وليست صعبة كما قد يعتقد البعض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر جين Selegue ، هولينجسورث مارغريت ، بيري جين ، Futahashi ريو ، Najmus محفوظ سحر Popadic الكسندر بوب ريد ، روش الدعم الفني للحصول على مساعدة في استكشاف هذا البروتوكول. ونحن نشكر أيضا وليم Piel للحصول على المشورة حول تحرير الفيلم.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5mg/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | C0612 | Mounting Medium |
References
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52 (2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55 (2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
