Summary
Afin d'examiner l'expression des gènes dans les tissus des pupes de l'aile Bicyclus anynana, nous présentons un protocole optimisé pour les hybridations in situ en utilisant des ribosondes. Nous fournissons aussi des directives pour l'optimisation de ce protocole pour l'utilisation dans les ailes des pupes de espèces de lépidoptères autres.
Abstract
Nous présentons ici, en format vidéo, un protocole pour les hybridations in situ dans les ailes des pupes de l'anynana papillon Bicyclus utilisant ribosondes. Hybridations in situ, un pilier de la biologie du développement, sont utiles pour étudier la répartition spatiale et temporelle de l'expression des gènes dans le développement de tissus au niveau de la transcription. Si des anticorps qui ciblent les produits de protéine de transcription des gènes n'ont pas encore été développée, et / ou il ya de multiples copies du gène d'une protéine particulière dans le génome qui ne peuvent pas être différenciés en utilisant des anticorps disponibles, situs peut être utilisé à la place. Alors une technique in situ pour les disques ailes larvaires ont été offerts à la communauté papillon pour plusieurs années, le protocole actuel a été optimisé pour les ailes plus grandes et plus fragiles chrysalide.
Protocol
JOUR 1
- Préparer les solutions suivantes:
- 10x PBS
- 1x PBS
- 1x PBT
- ddH 2 O
- Ajouter DEPC pour un volume total de 0,1% et secouer vigoureusement solutions.
- Autoclave.
- Fix paraformaldéhyde à 4% - à l'aide de PBS-DEPC
- Solution de protéinase K - Si un précipité apparaît, vortexer vigoureusement avant de retirer aliquote
- Tampon d'arrêt Digestion
- Tampon de préhybridation
- 50:50 PBT: tampon de préhybridation
- Tampon d'Hybridation
- Les solutions doivent être conservés sans RNase. Utilisez soit verrerie qui a été cuit (4 heures à 250 ° C) ou en plastique jetables. Pipettes sérologiques sont très utiles pour la confection des solutions
- Disséquer les ailes du temps mis en scène les pupes dans le PBS
- Déplacer des ailes directement à Fix Buffer dans des puits de 24 plaques de culture bien à température ambiante
- Fixer les disques pendant 2 heures
- Laver 5 x 5 minutes en PBT
- Incuber ailes pendant 3 minutes dans la protéinase K solution
- Rincer 2 x dans le tampon d'arrêt Digestion
- Laver 5 x 5 minutes en PBT
- Lavez 2 x 5 minutes dans de 50:50 PBT: PHB
- Lavez 1 x 10 minutes en PHB
- Incuber dans PHB au moins 1 heure à 55 ° C.
- Heat-dénaturent sonde ARN (20-50 ng par puits nécessaire) (80 ° C pendant 5 minutes) et ajouter à tampon d'hybridation (100 pi par puits nécessaire)
- Ajouter la sonde de puits et incuber 48 heures à 55 ° C
JOUR 3
- Lavez 4 x 5 minutes dans 55 ° C PHB
- Incuber une nuit dans la PHB à 55 ° C
JOUR 4
- Préparer les solutions suivantes:
- Bloc tampon d'anticorps
- Lavez 1 x 5 minutes dans de 50:50 PBT: PHB
- Lavez 4 x 5 minutes en PBT
- Ailes Incuber pendant 1 heure dans un tampon de bloc à 4 ° C
- Incuber ailes dans une dilution 1:2000 d'anticorps anti-DIG nuit à 4 ° C
JOUR 5
- Préparer les solutions suivantes:
- Tampon de détection
- Solution de développement - (envelopper dans du papier) sensible à la lumière
- Laver 3 x 5 minutes en PBT à la température ambiante
- Lavez 7 x 5 minutes dans de PBT
- Rincer les ailes deux fois dans le tampon de détection
- Développer des ailes dans 1 ml de solution de développement - le temps de développement doivent être surveillés à chaque fois - les temps de développement peuvent changer, même en utilisant les mêmes sondes et la solution de développement - généralement vérifier après 5-10 minutes et ensuite augmenter intervalles jusqu'à la nuit. Plaque doit être enveloppé dans une feuille de prévenir l'exposition de lumière quand il n'est pas la vérification des échantillons.
- Rincer à cinq reprises en tampon d'arrêt de développement
- Mont ailes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optimisation des protocoles existants
Hybridations in situ sur des disques de l'aile des larves ont été réalisées avec succès en utilisant des disques à partir des papillons coenia Précis (Carroll et al, 1994;. Keys et al, 1999;. Weatherbee et al 1999).. Le protocole actuel a été adapté à partir d'un protocole écrit détaillé disponible sur demande auprès du laboratoire Carroll pour colorations aile larvaire. Les changements que nous a fait servir à tenir compte des différences entre les tissus des larves et des nymphes d'aile. Pendant nymphe dissections aile postérieure, la membrane peripodial doit être retiré et non inclus dans le puits. Le temps de repère initial est beaucoup plus long dans notre protocole, mais l'étape de post-fix a été supprimée. Nous avons constaté que d'une dilution de 10 fois de la solution de protéinase K a été nécessaire pour que les tissus fragiles ailes nymphe tout en permettant la pénétration de sonde avec succès. Nous avons également constaté que le blocage des ailes avant de coloration des anticorps fortement réduite fond, tandis que l'augmentation de l'incubation d'anticorps à une nuit à 4 ° C a augmenté la puissance du signal.
Applications
Les applications de ce protocole sont multiples. Etre capable de localiser l'expression d'un gène candidat sur une aile de développement nymphal sera la première étape en impliquant ce gène dans certaines rôle fonctionnel pendant le développement motif de l'aile ou des ailes (Marcus et al 2004;. Ramos et al 2006).. Si plusieurs gènes qui sont connus pour interagir dans d'autres systèmes sont co-exprimés ensemble sur les ailes ce qui peut impliquer la cooptation de plusieurs réseaux de gènes spécifiant les modèles élaborés dans l'aile roman (Monteiro et al. 2006). Aile de papillon modèle évo-dévo fournit un système riche où pertinentes évo-dévo questions touchant les processus de gènes et réseaux de gènes co-option, l'évolution des nouveautés, l'évolution des traits convergents et parallèles, l'évolution de l'homologie de série, et des gènes chevauchements et les sous-fonctionnalisation peuvent tous être étudiés d'une manière intégrée. Par ailleurs, des papillons d'afficher une variété ahurissante de modèles aile qui jouent un rôle dans la reconnaissance des espèces, la sélection sexuelle, le mimétisme, la thermorégulation, et l'évitement des prédateurs. Comprendre à la fois la base génétique et développement à la nouvelle génération de ces modèles, ainsi que les facteurs écologiques qui favorisent certains modèles peuvent nous amener à une compréhension holistique du processus d'évolution et de la partialité et les contraintes imposées par les systèmes de ce processus de développement.
Optimisation des lignes directrices pour l'adaptation aux différentes espèces
Lorsque l'adaptation de ce protocole d'ailes de différentes espèces, la principale préoccupation sera prise le tissu perméable à la sonde tout en maintenant l'intégrité des tissus. Par conséquent, les étapes de fixation et permeablization devra être optimisé. Pour Bicyclus ailes nymphe, nous avons constaté que une solution 2 heures à température ambiante dans l'IFP tampon frais et une digestion protéinase K douce est suffisante. Les tissus peuvent être fixés à 12 heures à 4 ° C si nécessaire, mais il est possible de sur-corriger tissu qui permettra de réduire le signal, temps de fixation pour courtes sont privilégiées. Tant la concentration de l'enzyme et de la longueur et la température de digestion doit être déterminée empiriquement pour chaque tissu. L'âge des ailes peut également être un facteur important dans la digestion que les anciens auront des ailes plus élaborées et les structures cuticulaires nay nécessitent une plus longue digestion. Il est important de se rappeler que les préparatifs à la protéinase K qui sont disponibles dans le commerce ne sont pas standardisés pour une activité spécifique et, par conséquent, les conditions de digestion peuvent aussi avoir besoin d'être ajustée en changeant lots. La perméabilité des tissus peut également être augmenté par incubation dans des solutions détergentes, par exemple un 1% de Triton-X solution. Cela pourrait être ajoutée avant l'étape de pré-hybridation.
Une autre préoccupation sera d'optimiser la taille de sonde, règle générale, être plus grand est meilleur. Bob Reed, qui a effectué fin aile nymphale dans situs dans Heliconius, a suggéré 300 pb en tant que dimension de la cible (communication personnelle). Agrandir les sondes, ce qui peut augmenter la spécificité du signal, peut être hydrolysée pour faciliter leur entrée dans les cellules. Dans d'autres systèmes, cependant, les chercheurs utilisent couramment une des sondes ko sans les hydrolyser. Ici nous avons utilisé des sondes autour de 300 pb ainsi ce qui a bien fonctionné.
Travailler avec ribosondes peut être intimidant pour les laboratoires ne servent pas à l'ARN de manutention. Nous avons trouvé que cette technique soit assez robuste pour contenir et de plusieurs étapes qui minimisent la perte de la sonde due à l'activité RNase. La digestion protéinase K va supprimer la contamination de RNase et le formamide 50% des tampons préhybridation / hybridation va inhiber l'activité RNase (Chomczynski 1992). Par conséquent, nous encourageons les gens à utiliser ribosondes qui augmentent la spécificité du signal et ne sont pas aussi lourd que certains peuvent penser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar mahfouz, Aleksandar Popadic, Bob Reed, Roche support technique pour aider au dépannage de ce protocole. Nous remercions également Guillaume Piel pour des conseils sur le montage du film.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5mg/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | C0612 | Mounting Medium |
References
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52 (2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55 (2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
