Summary
Bicyclus anynana의 pupal 날개 조직에서 유전자 발현을 조사하기 위해, 우리는 riboprobes를 사용하여 현장 hybridizations에 대한 최적화된 프로토콜을 제시한다. 우리는 또한 다른 Lepidopteran 종의 pupal 날개에 사용하기 위해이 프로토콜을 더욱 최적화에 대한 지침을 제공합니다.
Abstract
여기서 우리는, 비디오 형식, riboprobes를 사용하여 나비 Bicyclus anynana의 pupal 날개의 현장 hybridizations에 대한 프로토콜을 제시한다. 현장 hybridizations에서 발달 생물학의 의지는 전사 수준에서 조직 개발에 유전자 표현의 공간 및 시간적 패턴을 연구하는 데 유용합니다. 유전자 전사의 단백질 제품을 대상 항체가 아직 개발 및 / 또는 사용 가능한 항체를 사용하여 차별화된 수 없습니다 게놈에서 특정 단백질의 여러 유전자 사본이있다하지 않은 경우, 시터스 대신 사용할 수 있습니다. 애벌레 날개 디스크 현장 기술에 몇 년 동안 나비 커뮤니티에 제공하고있는 동안, 현재의 프로토콜은 더 큰 더 연약한 pupal 날개에 대한 최적화되었습니다.
Protocol
1 일
- 다음과 같은 솔루션을 준비 :
- 10X PBS
- 1X PBS
- 1X PBT
- ddH 2 O
- 0.1 % 총 볼륨의 DEPC를 추가하고 적극적으로 해결책을 흔들.
- 압력솥.
- 4 % Paraformaldehyde 픽스 - PBS - DEPC를 사용하여
- Proteinase K 솔루션 - 침전물이 존재하는 경우, 소용돌이 적극적으로 나누어지는를 제거하기 전에
- 소화 스톱 버퍼
- Prehybridization 버퍼
- 50:50 PBT : Prehybridization 버퍼
- 하이브 리다이 제이션 버퍼
- 솔루션은 RNase 무료 보관해야합니다. 어느 구운되었습니다 유리 도자기 (250에서 4시간 ° C) 또는 일회용 플라스틱을 사용합니다. Serological pipettes 솔루션을 만들기위한 매우 유용합니다
- PBS에서 가장 날개를 해부하다 시간 연출 pupae
- 상온에서 24 자 문화 판의 우물에서 버퍼를 해결하려면 직접 날개 이동
- 2 시간 동안 디스크를 수정
- PBT 5 X 5 분 와시
- Proteinase K 용액에서 3 분간 날개를 품어
- 소화 스톱 버퍼 2 X를 린스
- PBT 5 X 5 분 와시
- 50:50 PBT 2 X 5 분 와시 : PHB
- PHB 1 X 10 분 와시
- 55 PHB 적어도 1 시간에 품어 ° C.
- 열 변성 RNA 프로브 (20 - 50ng 잘마다 필요한) (80 ° C 5 분)와 하이브리드화 버퍼 (100 μl 아니라 당 필요)에 추가
- 우물에 프로브를 추가하고 55에서 48 시간 품어 ° C
3 일
- 55 4 X 5 분 씻어 ° C PHB
- 55 PHB에 밤새 품어 ° C
DAY 4
- 다음과 같은 솔루션을 준비 :
- 항체 블럭 버퍼
- PHB : 50:50 PBT 1 X 5 분 와시
- PBT 4 X 5 분 와시
- 4 블럭 버퍼에서 1 시간 동안 품어 날개 ° C
- 4 박 안티 파 항체의 1:2000 희석에 날개를 품어 ° C
5 일
- 다음과 같은 솔루션을 준비 :
- 감지 버퍼
- 개발 솔루션 - 민감한 빛 (호일에 포장)
- 상온에서 PBT 3 X 5 분 와시
- PBT의 와시 7 X 오분
- 감지 버퍼에 날개를 두 번 씻어
- 솔루션 개발 1 ML에 날개를 개발 - 개발의 시간은 각각의 시간을 모니터링해야합니다 - 동일한 프로브 및 개발 솔루션을 사용하면 개발 시간도 변경하실 수 있습니다 - 일반적으로 하루에 간격을 증가 후 50~10분 후 확인합니다. 플레이트는 샘플을 검사하지 않을 경우 빛의 노출을 방지하기 위해 호일에 싸여 있어야합니다.
- 개발 중지 버퍼 다섯 번 린스
- 날개를 탑재합니다.
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Discussion
기존 프로토콜의 최적화
애벌레 날개 디스크에 현장 hybridizations 성공적으로 대의 coenia의 나비의 디스크를 사용하여 수행되었습니다 (캐롤 외 1994;. 키 외 1999;. 웨더비 외 1999가).. 현재 프로토콜은 애벌레 날개 stainings에 대한 캐롤 연구소에서 요청에 따라 사용할 수있는 세부적인 서면 프로토콜에서 맞게되었습니다. 우리가 만든 변경 사항은 애벌레와 pupal 날개 조직 간의 차이를 수용할 수 있도록 제공하고 있습니다. pupal hindwing 해부 동안 peripodial 멤브레인가 우물에 제거하고 포함되지해야합니다. 초기 수정 시간은 우리의 프로토콜에 더 이상하지만 이후 수정 단계가 제거되었습니다. 우리는 Proteinase K 솔루션의 10 배 희석은 여전히 성공적인 프로브 침투에 대한 허용하면서 깨지기 쉬운 pupal 날개 조직에 필요한 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 발견 날개를 차단 항체 얼룩이 크게 감소 배경을하기 전에 4 하룻밤에 항체 보육을 증가 반면 ° C 신호의 강도를 증가.
애플 리케이션
이 프로토콜의 응용 프로그램 매니폴드 있습니다. 개발 pupal 날개에 후보 유전자의 표현을 집중 수있다는 것은 날개 날개 패턴 개발하는 동안 일부 기능 역할이 유전자를 연루의 첫 단계가 될 것입니다 (마커스 외 2004;. 라모스 외 2006.). 다른 시스템에 상호 작용하는 것으로 알려져 있습니다 몇 가지 유전자가 날개에 함께 공동 표현하는 경우에는이 소설 날개 패턴을 지정하는보다 정교한 유전자 네트워크의 공동 옵션을 연루될 (몬테 외 있습니다. 2006). 나비 날개 패턴 에보 (Evo) - devo는 관련 에보 (Evo) - devo 질문은 유전자 및 유전자 네트워크 공동 옵션 보지 못하던 상품의 진화, 수렴 및 병렬 특성의 진화는 일련 상동의 진화, 그리고이 유전자에게의 프로세스와 관련된 풍부한 시스템을 제공합니다 중복 및 하위 작용화은 모든 통합 방식으로 공부하실 수 있습니다. 또한, 나비, 종족 인식, 성적 선택, 흉내, thermoregulation, 그리고 약탈 방지에 역할을 날개 패턴 어지러울 다양한 표시됩니다. 이러한 패턴의 생성 뒤에 유전과 발달 기초뿐만 아니라 특정 패턴을 선호 생태 요인을 모두 이해하는 것은 진화 과정의 발달 체제에서이 프로세스에 따라 부과 편견과 제약의 전체적인 이해 우리를 가져올 수 있습니다.
종에 적응을위한 최적화 지침
여러 종의 날개이 프로토콜을 적응 때, 주요 관심사는 조직의 무결성을 유지하면서 프로브에 대한 조직 융화가 될 것입니다. 따라서, 고정 및 permeablization 단계는 최적화해야합니다. Bicyclus pupal 날개 들어, 우리는 신선한 PFA 버퍼와 부드러운 Proteinase의 K의 소화에 실온에서 2 시간 수정이 충분 것으로 나타났습니다. 조직은 4 ° C 필요한 경우 12 시간까지 고정하지만 신호를 줄일 수 이상 - 수정 조직 수 있습니다 수 있으므로 짧은 고정 시간 선호하고 있습니다. 효소 농도와 소화의 길이와 온도 모두는 각 조직에 대해 경험적으로 결정하여야한다. 이전 날개보다 정교한 cuticular 구조를 가지고 보게 이상 소화를 필요로하므로 날개의 시대도 digestions에서 중요한 요소 수 있습니다. 그런 상업적으로 사용할 수 있습니다 Proteinase K의 준비 따라서, 특정 활동에 대한 표준화되지 않고 기억하는 것이 중요합니다, 소화 조건도 많이 변경시 조정해야 할 수도 있습니다. 조직의 투자율은 또한 1 %의 트리톤 - X 솔루션은 예를 들어, 세제 솔루션에 부화 증가 수 있습니다. 이것은 전에 prehybridization 단계에 추가할 수 있습니다.
또 다른 우려는 프로브의 크기를 최적화하는 것입니다, 크고되고 엄지의 일반적인 규칙은 좋습니다. Heliconius에 시터스 늦은 pupal 날개를 수행 밥 리드, 대상의 크기 (개인 통신)로 300 BP를 제안했다. 큰 프로브는 신호의 특이성을 증가시킬 수있는, 세포에 자신의 항목을 돕기 위해 분해 수 있습니다. 다른 시스템에서는, 그러나, 연구자들은 정기적으로 그들을 hydrolyzing 않고 1킬로바이트 프로브를 사용합니다. 우리가 잘 작동뿐만 아니라 300bp 주위에 프로브를 사용합니다.
riboprobes 작업이 처리 RNA에 사용하지 실험실에 대한 위협하실 수 있습니다. 우리는 매우 강력해야하고 RNase의 활동으로 인해 프로브의 손실을 최소화 몇 가지 단계를 포함하는이 기술을 발견했다. Proteinase K의 소화는 RNase의 오염을 제거하고 prehybridization / 하이브리드화 버퍼의 50 % 포름 아미드는 (Chomczynski 1992) RNase 활동을 억제합니다. 따라서, 우리는 사람들이 신호의 특이성을 증가 riboprobes를 사용하는 것이 좋습니다 일부가 생각만큼 어려운되지 않습니다.
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Acknowledgments
우리는 제인 Selegue, 마가렛 홀링스워스, 진 베리, 료 Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, 알렉산더 Popadic, 밥 리드,이 프로토콜을 문제 해결에 대한 도움을 로체 기술 지원을 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 동영상을 편집에 대한 조언 윌리엄 피엘 감사합니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5mg/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | C0612 | Mounting Medium |
References
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