Summary
För att undersöka genuttryck i PUPP-flygeln vävnad Bicyclus anynana presenterar vi ett optimerat protokoll för in situ hybridizations med riboprobes. Vi ger också riktlinjer för ytterligare optimering av detta protokoll för användning i PUPP-vingar av andra ordningen fjärilar arter.
Abstract
Här presenterar vi, i videoformat, ett protokoll för in situ hybridizations i PUPP-vingar fjäril Bicyclus anynana med riboprobes. In situ hybridizations, en stöttepelare i utvecklingsbiologi, är användbara för att studera den rumsliga och tidsmässiga mönster av genuttryck för att utveckla vävnader i nivå med transkriptionen. Om antikroppar som riktar proteinet produkter gentranskription ännu inte har utvecklats, och / eller det finns flera gen kopior av ett visst protein i arvsmassan som inte kan differentieras med hjälp av tillgängliga antikroppar, kan i situs användas i stället. Medan en in situ teknik för larver vingen skivor har varit tillgängliga för fjäril gemenskapen under flera år, har den nuvarande protokollet är optimerad för de större och mer ömtåliga PUPP-vingar.
Protocol
DAG 1
- Förbered följande lösningar:
- 10x PBS
- 1x PBS
- 1x PBT
- DDH 2 O
- Lägg DEPC för 0,1% total volym och skaka lösningar kraftigt.
- Autoklav.
- 4% Paraformaldehyd Fix - med hjälp av PBS-DEPC
- Proteinas K-lösning - om fällning närvarande, virvel kraftigt innan du tar bort alikvot
- Matsmältning Stoppa Buffer
- Prehybridization Buffer
- 50:50 PBT: Prehybridization Buffer
- Hybridisering Buffer
- Lösningarna skall förvaras RNase-fri. Använd antingen glas-ware som har bakat (4 timmar vid 250 ° C) eller disponibel plast. Serologiska pipetter är mycket användbara för att göra upp lösningar
- Dissekera vingar från tid iscensatt puppor i PBS
- Flytta vingar direkt till Fix buffert i brunnar på 24 och kultur plattan vid rumstemperatur
- Fix skivor för 2 timmar
- Tvätta 5 x 5 minuter i PBT
- Inkubera vingar i 3 minuter i proteinas K-lösning
- Skölj 2 x i matsmältningen Stoppa Buffert
- Tvätta 5 x 5 minuter i PBT
- Tvätta 2 x 5 minuter i 50:50 PBT: PHB
- Tvätta 1 x 10 minuter i PHB
- Inkubera i PHB minst 1 timme vid 55 ° C.
- Värme-denaturera RNA sond (20-50ng behövs per brunn) (80 ° C i 5 minuter) och lägga till hybridisering buffert (100 l behövs per brunn)
- Lägg sond i brunnarna och inkubera 48 timmar vid 55 ° C
DAG 3
- Tvätta 4 x 5 minuter i 55 ° C PHB
- Inkubera över natten i PHB vid 55 ° C
DAG 4
- Förbered följande lösningar:
- Antibody Block Buffer
- Tvätta 1 x 5 minuter i 50:50 PBT: PHB
- Tvätta 4 x 5 minuter i PBT
- Inkubera vingar i 1 timme i Block buffert vid 4 ° C
- Inkubera vingar i ett 1:2000 utspädning av anti-Dig antikropp över natten vid 4 ° C
DAG 5
- Förbered följande lösningar:
- Upptäckt Buffer
- Utveckla Solution - ljuskänsliga (linda i folie)
- Tvätta 3 x 5 minuter i PBT vid rumstemperatur
- Tvätta 7 x 5 minuter i PBT
- Skölj vingar två gånger i Detection Buffert
- Utveckla vingar i 1 ml av u-lösning - tid för utveckling måste följas upp varje gång - att utveckla gånger kan förändras även när du använder samma givare och utveckla lösningen - i allmänhet kolla efter 5-10 minuter och sedan öka intervall upp till över en natt. Tavla bör slås in i folie för att förhindra ljusexponering när de inte kontrollerar prover.
- Skölj fem gånger i utvecklingsländerna Stoppa Buffert
- Mount vingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optimering av befintliga protokoll
In situ hybridizations på larver vinge skivor har framgångsrikt utförts med skivor från Precis coenia fjärilar (Carroll et al 1994;. Keys et al 1999;. Weatherbee et al 1999.). Det aktuella protokollet har anpassats från ett skriftligt detaljerat protokoll fås på begäran från Carroll Lab för larver vinge stainings. De förändringar vi gjort tjänar till att rymma skillnader mellan larver och PUPP-vinge vävnader. Under PUPP-hindwing dissektioner bör peripodial membranet tas bort och ingår inte i brunnarna. Den initiala fixa tid är mycket längre i våra protokoll, men efter fix steg har tagits bort. Vi fann att en 10-faldig utspädning av det proteinas K-lösning var nödvändig för den bräckliga PUPP-flygeln vävnad och samtidigt tillåta för framgångsrika sond penetration. Vi fann också att blockera vingarna innan antikroppen färgning kraftigt reducerad bakgrund, medan ökar antikropp inkubation över natten vid 4 ° C ökad signalstyrka.
Applikationer
Tillämpningar av detta protokoll är många. Att kunna lokalisera ett uttryck för en kandidat gen på en utveckling PUPP-vingen kommer att bli det första steget i att ifrågasätta denna gen i vissa funktionella roll under vinge eller vingar mönster utveckling (Marcus et al 2004;. Ramos m.fl. 2006.). Om flera gener som är kända för att interagera med andra system är co-uttrycks tillsammans på vingarna kan detta förutsätter en samtidig möjlighet att noggrannare gen nätverk ange nya flygeln mönster (Monteiro et al. 2006). Fjäril vingar mönster Evo-Devo ger en rik system där relevant Evo-Devo frågor som rör processer av genen och genen nätverk co-alternativet, utvecklingen av nyheter, utvecklingen av konvergerande och parallella drag, utvecklingen av seriell homologi och av gener dubbelarbete och sub-funktionalisering alla kan studeras i ett integrerat sätt. Dessutom fjärilar visa en förvirrande mängd olika vinge mönster som spelar en roll i arter erkännande, sexuell selektion, mimik, thermoregulation och rovdjur undvikande. Att förstå både genetiska och utvecklingsmässiga grunden bakom uppkomsten av dessa mönster, liksom de ekologiska faktorer som gynnar vissa mönster kan leda oss till en holistisk förståelse av de evolutionära processen och de fördomar och begränsningar som ålagts denna process genom utveckling system.
Optimering riktlinjer för anpassning till olika arter
Vid anpassning av protokoll till vingar av olika arter, kommer det största problemet att göra den vävnad genomsläppliga till sonden samtidigt som integriteten i vävnaden. Därför kommer fixering och permeablization steg måste optimeras. För Bicyclus PUPP-vingar, har vi funnit att en 2 timmars fix i rumstemperatur i färskt PFA buffert och en mild proteinas K matsmältning är tillräcklig. Vävnader kan fastställas upp till 12 timmar vid 4 ° C om det behövs men det är möjligt att över-fix vävnad som kommer att minska signalen, så kortare fixering gånger att föredra. Både enzymet koncentration och längd och temperatur matsmältningen bör bestämmas empiriskt för varje vävnad. Åldern på vingarna kan också vara en viktig faktor i digestions som äldre vingar kommer att ha mer avancerade cuticular strukturer och ja kräver en längre matsmältning. Det är viktigt att komma ihåg att proteinas K preparat som finns i handeln inte är standardiserade för en specifik aktivitet och kan därför matsmältningen villkor måste också justeras vid byte av delar. Permeabiliteten av vävnader kan också ökas genom inkubering i tvättmedel lösningar, till exempel en 1% Triton-X lösning. Detta kan läggas före prehybridization steg.
Ett annat bekymmer är att optimera sond storlek är tumregel är större bättre. Bob Reed, som har utfört sena PUPP-vinge i situs i Heliconius föreslog 300 bp som mål storlek (personlig kommunikation). Större sonder, som kan öka specificiteten hos signalen, kan hydrolyseras att bistå deras inträde i cellerna. I andra system, men forskare använder rutinmässigt 1 kb sonder utan hydrolyzing dem. Här har vi använt sonder runt 300bp såväl som fungerade bra.
Arbeta med riboprobes kan vara skrämmande för laboratorier inte vana att hantera RNA. Vi har funnit denna teknik vara ganska robust och innehålla flera steg som minimerar förlusten av sond pga RNas aktivitet. Den proteinas K matsmältningen kommer att ta bort RNase smitta och 50% formamid av prehybridization / hybridisering buffertar kommer att hämma RNas aktivitet (Chomczynski 1992). Därför uppmuntrar vi människor att använda riboprobes som ökar specificiteten hos signalen och är inte så svårt som vissa kanske tror.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadic, Bob Reed, Roche tekniska support för hjälp med felsökning av detta protokoll. Vi tackar också William Piel för råd om att redigera filmen.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5mg/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | C0612 | Mounting Medium |
References
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52 (2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55 (2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
