Étiquetage DiOLISTIC des neurones à partir de rongeurs et non-humains tranches de cerveau des primates

Summary

Nous démontrons l'utilisation du pistolet à gènes à introduire des colorants fluorescents, tels que DII, en neurones dans des tranches de cerveau de rongeurs et des primates non humains d'âges différents. Dans ce cas particulier, nous utilisons des souris adultes (3-6 mois) et adultes singes cynomologus (9-15 ans). Cette technique, décrite initialement par le laboratoire du Dr Lichtman (Gan

Abstract

Coloration DiOLISTIC utilise le pistolet à gènes à introduire des colorants fluorescents, tels que DII, en neurones de tranches du cerveau (Gan et al, 2009;. O'Brien et Lummis, 2007; Gan et al, 2000).. Ici, nous fournir une description détaillée de chaque étape nécessaire avec des images exemplaires des résultats bons et les mauvais qui vous aideront lors de la création de la technique. Dans notre expérience, à quelques pas prouvé critique pour l'application réussie de DiOLISTICS. Ces considérations incluent la qualité de la DII-balles couché, le degré d'exposition fixateur, et la concentration des détergents utilisés dans les solutions d'incubation. Conseils et solutions pour les problèmes communs sont fournis.

C'est une technique de marquage polyvalent qui peut être appliqué à de nombreuses espèces animales à un large éventail d'âges. Contrairement à d'autres techniques de marquage fluorescent qui sont limitées à la préparation de jeunes animaux ou restreinte à des souris car elles reposent sur l'expression d'un transgène fluorescente, l'étiquetage DiOLISTIC peut être appliqué aux animaux de tous âges, des espèces et des génotypes et il peut être utilisé en combinaison avec immunomarquage pour identifier une sous-population spécifique de cellules. Ici nous démontrer l'utilisation des DiOLISTICS aux neurones étiquette dans des tranches de cerveau de souris adultes et adultes de primates non humains dans le but de quantifier les dendrites de branchement et de la morphologie des épines dendritiques.

Protocol

1. Préparation DiI / tungstène Bullets perle: DiI (1-1'-dioctadécyl-3, 3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) balles doivent être préparées à l'avance de la coupe des tranches de cerveau. La procédure prend environ 2-4 heures selon le nombre de balles sont préparés à la fois.

1. Si à partir d'un nouveau lot de perles de tungstène, de préparer des aliquotes de 300 mg chacune. Aliquotes sont préparées par la suspension de 6 grammes de tungstène dans 2 ml de chlorure de méthylène. Puis, une pipette 100 pi de solution billes dans des tubes de centrifugeuse pour produire des aliquotes de 300 perles de tungstène mg aliquotes Stocker à température ambiante (Remarque: le chlorure de méthylène s'évapore très rapidement alcool peut aussi être utilisé minimiser l'évaporation.)...
2. Lors du démarrage d'aliquotes de perles, resuspendre chaque aliquote (300 perles de tungstène mg) dans 300 pl de chlorure de méthylène et le couvercle rapidement pour éviter l'évaporation. Cette quantité est suffisante pour 3 lots de balles.
3. Préparer la solution de teinture en pesant 13,5 mg de DiI colorant lipophile et l'ajout de 450 ul de chlorure de méthylène (concentration finale = 3mg/100μl).
4. Enduire les perles avec la teinture. Placer une lame de verre sur un morceau de cire revêtu de peser le papier et la pipette 100 ul de billes sur la lame. Ajouter 100 pi de solution de DII, bien mélanger à l'aide pointe de la pipette, et l'air sec jusqu'à perles deviennent gris léger.
5. Utilisez une lame de rasoir pour gratter des perles de la lame de verre et dés les perles dans une poudre fine (Note: utiliser une nouvelle lame si, ce faisant plus d'une couleur de balles afin de ne pas contaminer les colorants)..
6. Grattez perles sur le poids des perles en papier et entonnoir dans un tube de 15 ml conique. Ajouter 3 ml d'eau et soniquer au bain-marie pendant 10-30 min à température ambiante (Note: dés de la poudre et sonication sont appliqués à minimiser la formation d'amas de billes revêtues qui vont perturber l'étiquetage clairsemées de neurones individuels)..

2. Préparer la polyvinylpyrrolidone (PVP) et les tubes solution: Pour améliorer l'attachement perles à la tubulure de balle (tube TEZFEL), il couche avec la polyvinylpyrrolidone (PVP) solution.

1. Préparer 10 ml de solution de PVP dans de l'eau à une concentration de 10 mg PVP / ml.
2. Utiliser une seringue de 12 ml avec adaptateur tuyau (tuyau flexible d'un diamètre légèrement plus grand) de passer à la solution de PVP à travers le tube de balle et puis l'expulser à l'autre extrémité. Réutiliser solution à tube robe plus bullet Si plusieurs lots sont préparés simultanément. Jeter la solution PVP après utilisation.
3. Pour ajouter des perles à la tubulure de balle, les perles de vortex pour produire une solution homogène et l'utilisation de la seringue pour tirer la solution de billes à travers le tube de telle sorte que les perles sont uniformément réparties sur toute la tuyauterie. ((Note:) essayer de minimiser le nombre de bulles d'air dans le tuyau).
4. Flux du tube à travers la station de préparation et de permettre aux billes de s'installer. Utiliser la seringue pour enlever délicatement l'eau de sorte que seuls les billes restent.
5. Spin le tube dans la station de préparation et sécher avec du gaz azote jusqu'à gouttelettes d'eau ne sont plus visibles. Cette étape prendra environ 10-20 min.
6. Couper les balles avec coupe-tube en 13 mm de longueur et les placer dans des flacons à scintillation contenant Drierite ou une sorte de sulfate de calcium anhydre. Enveloppez dans du papier flacons à l'abri de la lumière.

3. Coloration DiI: Cette technique de marquage peut être utilisé pour colorer les neurones dans le cerveau à partir d'espèces diverses; dans ce cas particulier, à partir de la souris (3-6 mois) et des primates non humains (9-15 ans).

Il est préférable que les tranches sont préparées à partir de tissu cérébral obtenu par perfusion fixe transcardiaque des solution de fixation parce que la préservation du tissu devrait être mieux sous cette condition. Toutefois, la fixation par perfusion n'est pas toujours possible (comme ce fut le cas avec le tissu de singe) et l'étiquetage DiOLISTIC peut encore être appliquée avec succès dans des procédures différentes pour la préparation des tissus. Nous décrivons ici trois procédures différentes pour la préparation des tissus:

1. Fixer le cerveau par perfusion transcardiaque → retirer du cerveau → postfix pendant 10 min → tranche coupé → tache
2. Retirer du cerveau → bloc de coupe de tissu → → bloc corriger laver dans du PBS tranche coupé → → tache
3. Retirer du cerveau → tranches coupées → → corriger lavez → tache

Dans la présente étude, la cervelle de singe ont été obtenus à partir de sujets qui ont été perfusés avec transcardiaque glacée artificielle du fluide céphalo-rachidien (ACSF) avant la récolte du cerveau et d'un bloc (4 mm d'épaisseur) de tissu contenant le noyau caudé uneND putamen a été fixé pendant 60 min à température ambiante. Pour toutes les procédures, la solution de fixation contient paraformaldéhyde 4% et 4% de saccharose dans du PBS (préparé frais ou utilisés dans les 15 jours). Il est important de noter que les délais de fixation sont essentiels pour la coloration réussie. Overfixation peut affecter coloration en perturbant l'intégrité de la membrane plasmique et causant colorant pour s'échapper de la cellule (voir plus d'informations au titre des résultats).

1. Pour la procédure a et b, des tranches (200μm) sont coupées à partir du cerveau fixe ou bloc de tissu et placés dans des tranches de 24 puits plaque avec du PBS. Pour la procédure c, frais tranches cérébrales aiguës (200 um) sont coupés avec un vibratome en solution de découpe à froid contenant (en mm) 110 choline-Cl, 25 NaHCO _3, 1,25 NaH ₂ PO _4, 2,5 KCl, CaCl ₂ 0,5, MgCl 7 _2, 25 de glucose, l'acide ascorbique 11,6, 3,1 acide pyruvique (osmolarité = 310 mOsmols) et immédiatement après les tranches sont placées dans des plaques 24 puits et fixes pendant 30 min avec la solution de fixation à la température ambiante.
2. Laver les tranches avec du PBS, 3 fois.
3. Avant de tranches de tir, retirer le CPE dans les puits et, en utilisant un pinceau, placez la tranche dans le centre du puits.
4. Tirez des balles DiI travers un papier filtre 3,0 um en utilisant un système Hélios Gene Gun à 120-180 psi gaz hélium en plaçant le pistolet à une distance de 1,5 cm entre l'échantillon et l'extrémité du canon.
   (Note importante:. Neurones Seul rayon de 50 mm de la surface de tranche seront étiquetés par cette méthode il est donc important de garder le même côté de la tranche vers le haut au cours des lavages et pour le montage De cette façon, vous vous assurerez que les neurones marqués sera à une distance focale lorsque l'imagerie avec un microscope confocal).
5. Laver les tranches avec du PBS 3 fois et de les stocker dans du PBS pendant plusieurs heures afin de permettre DII à se répandre le long des dendrites.
6. Mont tranches sur une lame de verre avec Prolongez Antifade or et couvrir avec une lamelle No.1 18x18 mm. (Note: pour la procédure C, il est préférable de monter les tranches sur le même jour que l'intégrité des tranches n'est pas bien entretenu toute la nuit).
7. Sceller avec du vernis à ongles clair après les médias de montage a séché.
8. Alternativement, les tranches peuvent être colorées avec des anticorps avant le montage comme décrit ci-dessous.
   (Note: Les diapositives peuvent être utilisées au moins 6 mois à un an s'il est stocké dans l'obscurité à 4 ° C. Dii est sensible à la lumière d'exposition et à long terme à la lumière provoque la tache à s'estomper).

4. Coloration des anticorps: Immunocoloration doit être effectuée après l'étape 3.4 et avant le montage.

1. Perméabilisation: tranches Incuber dans 0,01% de Triton X-100 dans une solution PBS pendant 15 min à température ambiante (300-500 pi par puits).
   REMARQUE: Ne pas utiliser des concentrations plus élevées de détergent car cela va se dissoudre DII et réduire de façon significative la fluorescence. Essayez de minimiser le temps de détergent incubations vaste permettra également de réduire l'étiquetage DII. Si incubations étendues sont nécessaires, garder des tranches dans du PBS plutôt que dans une solution de blocage.
2. Blocage: tranches Incuber dans une solution de blocage contenant du sérum de chèvre 10%, 0,01% de Triton X-100 dans du PBS pendant 30 min à température ambiante.
3. L'anticorps primaire: Ajouter des anticorps à la dilution souhaitée dans une solution de blocage (lapin, par exemple des anticorps anti-GFP au 1:1000 dilution). Ajouter 300 à 500 pi par puits et incuber pendant 1-2 heures. (Note: si incubations nuit sont nécessaires, enlevez détergent de la solution de blocage).
4. Laver les tranches avec du PBS pendant 5 - 15 min, 3 fois.
5. L'anticorps secondaire: Incuber avec l'anticorps secondaire pendant 30 min à température ambiante. Préparer une solution d'anticorps secondaire à la dilution souhaitée dans une solution de blocage (par exemple, Alexa Fluor 488-anticorps conjugué à la dilution de 1:1000).
6. Laver les tranches avec du PBS pendant 5-15 minutes, 4 fois.
7. Mont tranches sur des diapositives avec Prolongez Antifade or et couvrir avec une lamelle No.1 18x18 mm. Sceller avec du vernis à ongles après que les médias de montage a séché.

5. Les résultats représentatifs:

1. Vérification de l'étiquetage correct: Section peuvent être visualisées sous un champ fluorescentes dissection équipé d'une lampe au mercure et rouges fluorescentes cube de filtre pour confirmer succès étiquetage DiOLISTIC. La figure 1 montre les images exemplaire de coupes de cerveau bien étiqueté obtenu à faible grossissement. Deux caractéristiques importantes à rechercher sont un modèle d'étiquetage éparse (figure 1A) et la capacité d'identifier les différents composants cellulaires (figure 1B-C). Dépannage étiquetage DiOLISTIC: La figure 2 montre des exemples de sections dans lesquelles l'étiquetage DiOLISTIC travaillé correctement. Dans notre expérience, il ya trois causes principales pour l'étiquetage inefficaces:
   • L'étiquetage est trop clairsemée ou dense: très peu de cellules sont marquées par section dans un cas ou trop de cellules sont marquées prévenir l'isolement et l'étude des éléments cellulaires simples. Solution: ajuster la concentration de billes revêtues dans la solution finale utilisée pour le revêtement des tubes de balles TEFZEL (section 1.6). Diminuer ou augmenter le volume d'eau (3 ml valeur initiale) utilisé pour dissoudre les perles afin de corriger pour l'étiquetage trop éparses ou trop dense, respectivement. En outre, la faible efficacité de l'étiquetage pourrait être causée par la pression du gaz moins optimale lorsque vous photographiez des perles enduit sur les sections. Cette possibilité peut être écartée en faisant en sorte que le tube balles TEFZEL a libéré la plupart des billes revêtues et il semble évident après le tournage. Sinon, la pression du gaz pour le tir devrait être augmenté.
   • Balles Bad: bouquets ou en grappes de perles de tungstène recouvert de teinture sont formés lors de la préparation de balle. Les articles seront ressemblent exemples de la figure 2A-B. Solution: faire des balles de nouveaux accordant une attention particulière à la section 1.5 et / ou de prolonger le temps sonication dans la section 1.6.
   • Plus de fixation: le tissu est conservé dans une solution de paraformaldéhyde pendant plus de façon optimale le temps nécessaire pour la fixation (30 minutes pour 200 à 300 um sections, 1 heure pour 4 sections mm). Cela compromet l'intégrité de la membrane plasmique et produit sections intitulées qui ressemblent à celles présentées dans la figure 2C-D dans laquelle l'étiquetage semble floue à cause de la dispersion du colorant hors des cellules. Solution: réduire le temps de fixation.
2. Imagerie confocale: des piles d'images sont acquises avec un microscope confocal (Zeiss LSM 510 META) avec un objectif 20x pour la cellule entière et 63x objectif à immersion d'eau pour des segments de dendrite. DiI était excité en utilisant un laser à 561 DPS ligne nm et la fluorescence verte de l'anticorps secondaire était excité en utilisant une ligne à 488 nm du laser. Le sectionnement optique de l'échantillon étiqueté obtenu lors de l'utilisation de microscopie confocale permet en outre pour l'isolement de simples cellules marquées dans l'échantillon. La figure 3A montre un neurone du striatum moyenne épineuse du cerveau de souris et de son schéma complexe branche dendrite. Des images à fort grossissement des branches des dendrites de ces neurones à partir de rongeurs (figure 3B) et primate non-humain (figure 3C) montrent le degré de coloration dans les dendrites et les épines dendritiques utilisant cette technique dans les deux espèces. Dendrites et leurs saillies (épines) semblent bien définis, même si l'on considère la longue, maigre échine têtes si abondants dans les neurones épineux moyens.
   
   En combinant DiOLISTICS avec immunomarquage, l'imagerie confocale est également utile dans la localisation sans équivoque que la tache sur le même plan focal et la même cellule. La figure 4 montre un exemple de co-localisation de DiI étiquetage et immunocoloration pour la GFP dans une cellule unique. L'image est une pile (0,7 um-section z) obtenu à partir d'un morceau à partir d'un striatum de souris transgéniques exprimant la protéine fluorescente GFP sous le promoteur récepteur de la dopamine D1.

Figure 1. Étiquetage DiI de neurones dans des tranches de cerveau de primates non-humains. (A) l'image à faible grossissement d'une coupe de cerveau teinté contenant le noyau caudé à partir d'un macaque qui montre l'étiquetage des rares neurones avec DII. (BC) Isolé neurones épineux moyens peuvent être facilement identifiés en utilisant un champ fluorescentes dissection.

Figure 2. Dépannage étiquetage DiOLISTIC. (AB) tranches tachées du striatum dorsal du singe (A) et la souris (B) montrant de grosses touffes de colorant billes recouvertes et comme conséquence, aucun des éléments individuels cellulaires peuvent être distingués. (CD) Images qui illustrent le résultat de l'application DiOLISTIC l'étiquetage des articles qui ont été conservés dans la solution de fixation pour des périodes de temps prolongées ou lorsque la préservation des tissus échoué chez le singe (C) et la souris (D) des tissus.

Figure 3. Image confocale d'striatale moyenne épineuse neurone tachée de DII. (A), une pile d'images d'une cellule entière permet une analyse morphologique des branches dendritiques. Segments Dendrite (BC) de la souris (B) et le singe (C) neurones épineux moyens montrent un étiquetage clair des dendrites et des épines.

Figure 4. Combinant l'étiquetage DiOLISTIC avec immunomarquage. (A) DiI étiquetés (B). immunocoloration utilisant des anticorps anti-GFP anticorps tel que décrit par des méthodes adaptées de Lee et al. (2006). Même domaine que A. (C) Image composite de la fluorescence rouge et verte identifie DII-étiquetés neurone comme un neurone GFP-positives.

Discussion

Étiquetage DiOLISTIC est l'une des techniques les plus polyvalent disponible pour les cellules par fluorescence d'étiquetage, car elle peut être appliquée à des coupes de tissus à partir d'espèces diverses, à un large éventail d'âges, et pour les tissus obtenus à partir fixateur frais ou perfusés animaux (voir aussi Gan et al ., 2009). Le processus est relativement rapide car elle prend 1-2 jours et il peut être combiné avec d'autres approches plus classiques d'étiquetage telles que immunomarquage (Lee et al., 2006). Une attention particulière devrait être accordée afin d'éviter plus de fixation et l'utilisation de concentrations élevées dans les solutions de détergent d'incubation, car ces comprendra l'intégrité de la membrane lipophile, et provoquer la teinture de s'échapper des cellules. La pénétration d'anticorps peut être facilitée par de faibles concentrations de Triton X-100 (Lee et al., 2006), ainsi que la digitonine ou la saponine dans la solution d'incubation (Matsubayashi et al., 2008). Certaines modifications qui peuvent être appliqués à cette technique comprennent l'utilisation de balles avec des colorants multiples tel que décrit par Gan et al. (2000) ou en changeant la longueur et le type d'exposition d'anticorps (Neely et al., 2009).

Traditionnellement, Dii a été utilisé pour tracer des projections neuronales dans le cerveau. Étiquetage DiOLISTIC étend son application, en décrivant une méthode utile pour examiner la morphologie cellulaire. La morphologie neuronale est d'un grand intérêt en raison de la grande diversité dans le cerveau et la spéculation qui forme des cellules pourrait refléter la multiplicité fonction de populations de neurones dans le système nerveux. Un exemple de cela est le fait que de nombreux neurones dans le système nerveux des mammifères protubérance petit écran appelé épines dendritiques qui sont sur le site des synapses glutamatergiques. De cette façon, la densité des synapses glutamatergiques sur une cellule peut être corrélée à la densité des épines dendritiques, qui peut être mesurée en utilisant la technique de marquage décrits. Par ailleurs, d'autres paramètres morphologiques tels que la longueur totale des dendrites, modèle de branchement, la forme et la densité des épines dendritiques peuvent être quantifiées et étudiées.

L'utilisation d'un marquage fluorescent pour étudier la morphologie neuronale a de nombreux avantages par rapport aux techniques plus traditionnelles qui s'appuient sur la microscopie en champ clair (par exemple de Golgi coloration), car il permet pour l'imagerie haute résolution confocale. Un autre avantage d'utiliser DiI comme un fluorophore dans des expériences visant à mesurer la densité des épines dendritiques et leur morphologie est ses propriétés lipophiles. DiI partitions dans la membrane plasmique et donne un aperçu bien défini des processus neuronaux et protubérances dendritiques. Etant donné le faible volume de la plupart des épines dendritiques (moins de 1 femtoliter), coloration de la membrane est plus efficace et permet une meilleure visualisation des petits, des saillies minces que la coloration cytoplasmique.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI)	Invitrogen	D-282
Methylene chloride	Mallinckrodt Baker Inc.	H485-06
Tungsten beads	Bio-Rad	165-2269	1.7 μm diameter
Polyvinylpyrrolidone	Calbiochem	529504
Tefzel bullet tubing	Bio-Rad	165-2441
Tubing cutter	Bio-Rad	165-2422
Helios Gene Gun	Bio-Rad	165-2431
Isopore membrane filter paper	EMD Millipore	TSTP02500	3.0 μm pore size
ProLong Gold Antifade	Invitrogen	P36930
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	30525-89-4	(16% w/v)