DiOLISTIC Labeling van neuronen van de knaagdieren en niet-menselijke primaten Brain Slices

Summary

We demonstreren het gebruik van het gen pistool op fluorescente kleurstoffen, zoals DII, te introduceren in neuronen in de hersenen plakjes van knaagdieren en niet-menselijke primaten van verschillende leeftijden. In dit specifieke geval maken we gebruik van volwassen muizen (3-6 maanden oud) en volwassen cynomologus apen (9-15 jaar oud). Deze techniek, die oorspronkelijk beschreven door het laboratorium van Dr Lichtman (Gan

Abstract

DiOLISTIC vlekken maakt gebruik van het gen pistool tegen fluorescente kleurstoffen, zoals DII te introduceren, in de neuronen van de hersenen plakjes (Gan et al., 2009;. O'Brien en Lummis, 2007; Gan et al., 2000.). Hier hebben we een gedetailleerde beschrijving van elke stap samen nodig met voorbeeldige beelden van goede en slechte resultaten die zullen helpen bij het opzetten van de techniek. In onze ervaring, een paar stappen bleek cruciaal voor de succesvolle toepassing van DiOLISTICS. Deze overwegingen zijn de kwaliteit van de Dii-gecoate kogels, de mate van blootstelling aan fixeermiddel, en de concentratie van het wasmiddel worden gebruikt in de incubatie-oplossingen. Tips en oplossingen voor veel voorkomende problemen zijn voorzien.

Dit is een veelzijdige labeling techniek die kan aan meerdere diersoorten worden toegepast op een breed scala aan leeftijden. In tegenstelling tot andere fluorescente labeling technieken die beperkt zijn tot de voorbereidingen van jonge dieren of beperkt aan muizen, omdat ze vertrouwen op de expressie van een fluorescente transgen, kan DiOLISTIC etikettering worden toegepast op dieren van alle leeftijden, soorten en genotypes en het kan worden gebruikt in combinatie met immunokleuring naar een specifieke subpopulatie van cellen te identificeren. Hier laten we zien het gebruik van DiOLISTICS te labelen neuronen in de hersenen segmenten van volwassen muizen en volwassen niet-menselijke primaten met het doel van het kwantificeren dendriet vertakkingen en dendritische rug morfologie.

Protocol

1. Voorbereiden Dii / Tungsten Bead Bullets: DII (1-1'-Dioctadecyl-3, 3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat) kogels moeten worden voorbereid op voorhand te snijden hersenen plakjes. De procedure duurt ongeveer 2-4 uur, afhankelijk van hoeveel kogels zijn bereid in een keer.

1. Als uitgaande van een nieuwe batch van wolfraam kralen, voor te bereiden fracties van 300 mg per stuk. Monsters worden bereid door schorsing 6 gram van wolfraam in 2 ml methyleenchloride. Dan, om pipet 100 ul kraal oplossing in microfugebuizen buizen porties van 300 mg wolfraam kralen Store aliquots bij kamertemperatuur (Let op: dichloormethaan verdampt zeer snel Alcohol kan ook gebruikt worden te minimaliseren verdamping)....
2. Bij het opstarten van de monsters van kralen, resuspendeer elke hoeveelheid (300 mg wolfraam beads) in 300 pi methyleenchloride en cover snel om verdamping te voorkomen. Deze hoeveelheid is genoeg voor drie partijen kogels.
3. Bereid kleurstof oplossing door weging 13,5 mg van lipofiele kleurstof DII en het toevoegen van 450 pi methyleenchloride (eindconcentratie = 3mg/100μl).
4. De vacht van de kralen met kleurstof. Plaats een glasplaatje op een stuk van was-coated papier en wegen pipet 100 ul van kralen op de dia. Voeg 100 ul van Dii oplossing, meng goed met behulp van pipetpunt en drogen aan de lucht totdat kralen beurt lichtgrijs.
5. Gebruik een scheermesje om kralen schrapen het glas schuiven en de kralen dobbelstenen tot een fijn poeder (Opmerking: Gebruik een nieuw blad als dit meer dan een kleur van de kogels om zo niet kleurstoffen besmetten)..
6. Schraap kralen op de wegen papier en kralen in een trechter 15 ml conische buis. Voeg 3 ml water toe en in een waterbad gedurende 10-30 minuten bij kamertemperatuur ultrasone trillingen (Let op: snijden van het poeder en sonicatie worden toegepast om de vorming van klonten van de gecoate parels die de schaarse etikettering van individuele neuronen zal verstoren een minimum te beperken)..

2. Voorbereiden polyvinylpyrrolidon (PVP) oplossing en slangen: Om kraal gehechtheid te verbeteren om de kogel slang (TEZFEL buizen), jas met polyvinylpyrrolidon (PVP) oplossing.

1. Bereid 10 ml van de PVP-oplossing in water bij een concentratie van 10 mg PVP / ml.
2. Gebruik een 12 ml spuit met slang adapter (flexibele slang met een iets grotere diameter) aan de PVP-oplossing passeren de kogel slang en vervolgens verdrijven het uit het andere eind. Hergebruik oplossing voor de vacht meer bullet buis als er meerdere partijen tegelijkertijd worden voorbereid. Gooi PVP-oplossing na gebruik.
3. Toe te voegen de kralen om de kogel slang, vortex de kralen tot een homogene oplossing te produceren en gebruiken van de spuit om de kraal oplossing te trekken door de slang, zodat kralen zijn gelijkmatig verdeeld over de slang. ((Opmerking:) proberen om het aantal luchtbellen in de slang te minimaliseren).
4. Voer de slang door de prep-station en laat de kralen om zich te vestigen. Gebruik de spuit om verwijder voorzichtig het water, zodat alleen de kralen blijven.
5. Spin de slang in de prep-station en droog met stikstofgas tot waterdruppels zijn niet meer zichtbaar zijn. Deze stap duurt ongeveer 10-20 minuten.
6. Snijd kogels met slangen mes in 13 mm lengte en plaats in scintillatieflesjes met Drierite of een soort van watervrij calciumsulfaat. Wikkel flacons in folie ter bescherming tegen licht.

3. Dii kleuring: Deze labeling techniek kan worden gebruikt om de neuronen in het hersenweefsel vlek uit diverse soorten, in dit specifieke geval, van muis (3-6 maanden oud) en niet-menselijke primaten (9-15 jaar oud).

Het verdient de voorkeur dat de schijfjes worden bereid uit vaste hersenweefsel verkregen door transcardiac perfusie van fixatief oplossing omdat weefsel bewaren zal naar verwachting het beste worden onder deze voorwaarde. Echter, fixatie door perfusie is niet altijd haalbaar (zoals het geval was met de aap weefsel) en DiOLISTIC etikettering kan nog steeds met succes worden toegepast onder verschillende procedures voor het prepareren van weefsels. Hier beschrijven we drie verschillende procedures voor het prepareren van weefsels:

1. Fix hersenen door transcardiac perfusie → hersenen → postfix te verwijderen voor 10 min → gesneden plakje → vlek
2. Verwijder de hersenen → gesneden blok van weefsel → vast blok → wassen in PBS → gesneden plakje → vlek
3. Verwijder de hersenen → gesneden plakjes → fix → wassen → vlek

In de huidige studie werden de aap hersenen verkregen van onderwerpen die transcardially waren geperfuseerd met ijskoud kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) voorafgaand aan de hersenen oogst en een blok (4 mm dik) van weefsel met de caudate eennd putamen was vastgesteld voor 60 min bij kamertemperatuur. Voor alle procedures, fixeermiddel oplossing bevat 4% paraformaldehyde en 4% sucrose in PBS (vers bereid of gebruikt binnen de 15 dagen). Het is belangrijk op te merken dat fixatie tijden zijn essentieel voor een succesvolle kleuring. Overfixation kan invloed hebben op vlekken door het verstoren van de integriteit van het plasmamembraan en het veroorzaken van kleurstof uit lekken van de cel (zie voor meer informatie onder resultaten).

1. Voor procedure A en B, zijn schijfjes (200μm) snijden van vaste hersen-of weefsel blok en plakjes geplaatst in 24-wells plaat met PBS. Voor de procedure c, zijn vers acute hersen plakjes (200 micrometer), gesneden met een vibratome in koud snijden oplossing die (in mm) 110 Choline-Cl, 25 NaHCO _3, 1,25 NaH ₂ PO _4, 2,5 KCl, 0,5 CaCl _2, 7 MgCl _2, zijn 25 glucose, 11,6 ascorbinezuur, 3,1 pyrodruivenzuur (osmolariteit = 310 mOsmols) en onmiddellijk na plakjes geplaatst in 24-well platen en vaste gedurende 30 minuten met een fixatief oplossing bij kamertemperatuur.
2. Was de plakjes met PBS, 3 keer.
3. Voor het schieten plakjes, verwijder de PBS uit de putten en, met behulp van een penseel, plaatst u de plak in het midden van de put.
4. Schiet Dii kogels tot en met 3.0 micrometer filter papier met een Helios Gene Gun systeem op 120 tot 180 psi helium gas de druk door het plaatsen van het pistool op een afstand van 1,5 cm tussen het monster en het einde van het vat.
   (Belangrijke opmerking:. Alleen neuronen binnen 50 mm van de slice oppervlak zal gelabeld worden met deze methode dus het is belangrijk om de dezelfde kant van de plak naar boven te houden tijdens het wast en voor montage op deze manier, zult u ervoor zorgen dat de gelabelde neuronen zal binnen brandpuntsafstand bij beeldvorming met een confocale microscoop).
5. Was de plakjes met PBS 3 keer en bewaar ze in PBS gedurende enkele uren om de DII te verspreiden langs de dendrieten.
6. Monteren plakjes op een glasplaatje met ProLong Gold Antifade en bedek met een 18x18 mm No.1 dekglaasje aan. (Opmerking: voor de procedure c, is het het beste om plakjes te monteren op dezelfde dag als de integriteit van de plakken is niet goed 's nachts onderhouden).
7. Seal met duidelijke nagellak na montage van de media is opgedroogd.
8. Als alternatief kan de plakjes worden gekleurd met antilichamen voor de montage zoals hieronder beschreven.
   (Opmerking: Dia's kunnen gebruikt worden ten minste 6 maanden tot een jaar indien bewaard in het donker bij 4 ° C. Dii is lichtgevoelig en langdurige blootstelling aan het licht zal de vlek te vervagen).

4. Antilichaam kleuring: Immunokleuring moet worden uitgevoerd na stap 3.4 en voor de montage.

1. Permeabilisatie: Broed plakjes in 0,01% Triton X-100 in PBS-oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (300-500 ul per putje).
   LET OP: Gebruik geen hogere concentraties detergent, omdat dit zal oplossen DII en aanzienlijke vermindering van de fluorescerende vlekken. Probeer om de tijd te minimaliseren in detergent zo uitgebreid incubaties zal ook de DII etikettering. Als uitgebreid incubaties nodig zijn, blijven plakken in PBS in plaats van in het blokkeren van oplossing.
2. Blocking: Broed plakken in het blokkeren van oplossing met 10% geit serum, 0,01% Triton X-100 in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
3. Primair antilichaam: Voeg antilichaam op de gewenste verdunning in het blokkeren van oplossing (bijvoorbeeld konijn anti-GFP antilichaam bij 1:1000 verdunning). Voeg 300 tot 500 ul per putje en incubeer voor 1-2 uur. (Let op: als 's nachts incubaties nodig zijn, detergent te verwijderen uit het blokkeren oplossing).
4. Was de plakjes met PBS gedurende 5 - 15 min, 3 keer.
5. Secundair antilichaam: Broed met secundair antilichaam gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Bereid secundair antilichaam-oplossing op de gewenste verdunning in het blokkeren van oplossing (bv. Alexa Fluor 488-geconjugeerd antilichaam op 1:1000 verdunning).
6. Was de plakjes met PBS voor 5-15 min, 4 keer.
7. Mount plakjes op dia's met ProLong Gold Antifade en bedek het met een 18x18 mm No.1 dekglaasje aan. Seal met nagellak na montage media is opgedroogd.

5. Representatieve resultaten:

1. Controle voor de juiste etikettering: Sectie kan gevisualiseerd worden onder een tl-dissectie bereik uitgerust met een kwik lamp en rode fluorescente filter blokje om succesvol te DiOLISTIC etikettering te bevestigen. Figuur 1 toont voorbeeldige beelden van netjes gelabeld hersenen secties verkregen bij een lage vergroting. Twee belangrijke eigenschappen om te zoeken naar een schaars etikettering patroon (Figuur 1A) en de mogelijkheid om individuele cellulaire componenten (Figuur 1B-C) te identificeren. Het oplossen van problemen DiOLISTIC etikettering: Figuur 2 toont voorbeelden van stukken waarin de DiOLISTIC etikettering werkte niet goed. In onze ervaring, zijn er drie belangrijke oorzaken voor inefficiënt etikettering:
   • Labeling is te dun of dicht: Heel weinig cellen zijn gelabeld per sectie in een geval of te veel cellen zijn gelabeld het voorkomen van het isolement en de studie van afzonderlijke cellulaire elementen. Oplossing: pas de concentratie van de gecoate parels in de uiteindelijke oplossing wordt gebruikt voor het coaten van de TEFZEL kogel slang (paragraaf 1.6). Verlagen of verhogen van het volume van het water (3 ml initiële waarde) gebruikt om de kralen op te lossen, om te corrigeren voor te mager of te dicht etikettering, respectievelijk. Daarnaast kunnen lage efficiëntie van de etikettering worden veroorzaakt door een minder dan optimale gasdruk bij het fotograferen van de gecoate parels op de secties. Deze mogelijkheid kan worden uitgesloten door ervoor te zorgen dat de kogel TEFZEL slang heeft het grootste deel van de gecoate parels vrijgegeven en lijkt het duidelijk na de opname. Anders moeten gasdruk voor het schieten worden verhoogd.
   • Bad kogels: grote klonten of clusters van dye-gecoate wolfram kralen zijn gevormd tijdens de kogel voorbereiding. Secties zullen lijken op voorbeelden in figuur 2A-B. Oplossing: maak nieuwe kogels met bijzondere aandacht voor paragraaf 1.5 en / of sonicatie tijd in paragraaf 1.6 uit te breiden.
   • Over-fixatie: weefsel wordt bewaard in paraformaldehyde oplossing voor langer dan de optimale benodigde tijd voor de bevestiging (30 minuten voor 200-300 um secties, 1 uur voor 4 mm secties). Dit afbreuk doet aan de integriteit van het plasmamembraan en produceert gelabeld secties die lijken op die in figuur 2C-D, waarin de etikettering uit lijkt focus als gevolg van versnippering van de kleurstof uit de cellen. Oplossing: verminderen fixatie tijd.
2. Confocale beeldvorming: Image stapels worden verworven met behulp van een confocale microscoop (Zeiss LSM 510 META) met een 20x doelstelling voor de hele cel en 63x water immersie objectief voor dendriet segmenten. Dii was opgewonden met behulp van een DPS 561 nm laser-lijn en de groene fluorescentie van het secundaire antilichaam was blij met behulp van een 488 nm laser lijn. De optische sectie van de gelabelde monster bereikt bij het gebruik van confocale microscopie maakt verder voor het isoleren van een gelabelde cellen in het monster. Figuur 3A toont een striatale medium stekelige neuron uit de hersenen van muizen en de complexe dendriet tak patroon. Hoge vergroting beelden van dendriet takken van deze neuronen van de knaagdieren (figuur 3B) en niet-menselijke primaten (Figuur 3C) tonen de mate van kleuring in dendrieten en dendritische spines het gebruik van deze techniek in beide soorten. Dendrieten en hun uitsteeksels (stekels) lijken goed gedefinieerd, zelfs wanneer rekening houdend met de lange, dunne rug hoofden zo overvloedig in medium stekelige neuronen.
   
   Bij het combineren van DiOLISTICS met immunokleuringen, confocale beeldvorming is ook nuttig bij het ondubbelzinnig het lokaliseren van de vlek om dezelfde focal plane en dezelfde cel. Figuur 4 toont een voorbeeld van colocalization van DII etikettering en immunokleuring voor GFP in een enkele cel. Het beeld is een stack (0,7 micrometer z-sectie) verkregen uit een striatale slice van een transgene muis de uiting van de fluorescerende eiwit GFP onder de D1 dopamine receptor promotor.

Figuur 1. Dii etikettering van neuronen in de hersenen plakjes van niet-menselijke primaten. (A) lage vergroting beeld van een gekleurd stukje hersenen met de caudatus kern van een cynomolgusaap die schaarse etikettering van neuronen met Dii shows. (BC) Geïsoleerd medium stekelige neuronen kan gemakkelijk worden geïdentificeerd met behulp van een fluorescerende dissectie scope.

Figuur 2. Problemen oplossen DiOLISTIC etikettering. (AB) in lood segmenten van dorsale striatum van de aap (A) en de muis (B) met grote pollen van kleurstof-gecoate kralen en als gevolg daarvan, geen individuele cellulaire elementen kunnen worden onderscheiden. (CD) Beelden die de uitkomst van de toepassing DiOLISTIC illustreren etikettering secties die werden gehouden in fixeermiddel oplossing voor langere tijd of waar weefsel bewaren gefaald bij de aap (C) en muis (D) weefsel.

Figuur 3. Confocale beeld van striatale medium stekelige neuron gekleurd met DII. (A), Afbeelding stapel van een hele cel zorgt voor morfologische analyse van de dendritische takken. (BC) Dendrite segmenten van de muis (B) en aap (C) medium stekelige neuronen vertonen duidelijke etikettering van dendriet en stekels.

Figuur 4. De combinatie van DiOLISTIC etikettering met immunokleuring. (A) DII label (B) Immunokleuring gebruik van anti-GFP antilichaam zoals beschreven door methoden aangepast van Lee et al.. (2006). Hetzelfde veld als A. (C) composite afbeelding van rode en groene fluorescentie identificeert DII-gelabeld neuron als een GFP-positieve neuron.

Discussion

DiOLISTIC etikettering is een van de meest veelzijdige technieken beschikbaar voor het fluorescent etikettering van cellen, omdat het kan worden toegepast op weefsel van diverse soorten, om een breed scala van leeftijden, en het weefsel verkregen vers of uit fixatief-doorbloed dieren (zie ook Gan et al. ., 2009). Het proces is relatief snel als het duurt 1-2 dagen en kan worden gecombineerd met andere, meer klassieke etikettering benaderingen, zoals immunokleuring (Lee et al., 2006).. Speciale aandacht moet worden besteed om te voorkomen dat de vaststelling en het gebruik van hoge concentraties detergent in incubatie-oplossingen omdat deze de integriteit van de lipofiele membraan omvatten en ervoor zorgen dat de kleurstof uit lekken van de cellen. Antilichaam penetratie kan worden vergemakkelijkt door de lage concentraties van Triton X-100 (Lee et al., 2006)., Evenals digitonine of saponine in de incubatie-oplossing (Matsubayashi et al.., 2008). Enkele wijzigingen die kunnen worden toegepast om deze techniek onder andere het gebruik van kogels met meerdere kleurstoffen zoals beschreven door Gan et al.. (2000) of het veranderen van de lengte en het type van antilichaam blootstelling (Neely et al.., 2009).

Traditioneel is Dii is gebruikt om neuronale projecties in de hersenen op te sporen. DiOLISTIC etikettering breidt de toepassing ervan door het beschrijven van een methode nuttig om celmorfologie te onderzoeken. Neuronale morfologie is van groot belang vanwege de grote diversiteit in de hersenen en de speculatie dat de cel vorm zou kunnen nadenken over de functie veelheid van neuronale populaties in het zenuwstelsel. Een voorbeeld hiervan is het feit dat veel neuronen in het zenuwstelsel van zoogdieren systeem weer te geven klein uitsteeksel genaamd dendritische spines, die de site van glutamaat synapsen. Op deze manier kan de dichtheid van glutamaat synapsen op een cel worden gecorreleerd aan de dichtheid van de dendritische spines, die kan worden gemeten met behulp van de etikettering techniek die hierin worden beschreven. Bovendien kunnen andere morfologische parameters zoals dendriet totale lengte, vertakkende patroon, dendritische wervelkolom vorm en dichtheid worden gekwantificeerd en bestudeerd.

Het gebruik van fluorescerende de etikettering voor het bestuderen van neuronale morfologie heeft vele voordelen ten opzichte van meer traditionele technieken die afhankelijk zijn van helder veld microscopie (bijv. Golgi kleuring), omdat het zorgt voor een hogere resolutie confocale beeldvorming. Een ander voordeel van het gebruik van Dii als een fluorofoor in experimenten die gericht zijn op het meten van dendritische wervelkolom dichtheid en morfologie is de lipofiele eigenschappen. DII partities in het plasma membraan en zorgt voor een goed gedefinieerde schets van de neuronale processen en dendritische uitsteeksels. Gezien de geringe omvang van de meeste dendritische spines (minder dan 1 femtoliter), membraankleuring is efficiënter en zorgt voor een betere visualisatie van kleine, dunne uitsteeksels dan cytoplasmatische kleuring.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI)	Invitrogen	D-282
Methylene chloride	Mallinckrodt Baker Inc.	H485-06
Tungsten beads	Bio-Rad	165-2269	1.7 μm diameter
Polyvinylpyrrolidone	Calbiochem	529504
Tefzel bullet tubing	Bio-Rad	165-2441
Tubing cutter	Bio-Rad	165-2422
Helios Gene Gun	Bio-Rad	165-2431
Isopore membrane filter paper	EMD Millipore	TSTP02500	3.0 μm pore size
ProLong Gold Antifade	Invitrogen	P36930
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	30525-89-4	(16% w/v)