我々は、齧歯類と異なる年齢のヒト以外の霊長類の脳スライスの神経細胞に、そのようなDIIなどの蛍光色素を、導入する遺伝子銃の使用を示します。この特定のケースでは、我々は、成体マウス(3-6ヶ月齢)と成人cynomologusサル(9-15歳)を使用します。もともと博士リヒトマン(ガンの研究室で記述されたこの技術、<em>ら</em界面活性剤が低濃度に保たれている場合>。、2000)、、よく分岐樹状突起と樹状突起スパイン形態の研究に適していると従来の免疫染色と組み合わせることができます。
DiOLISTIC染色は、脳スライスの神経細胞(。。オブライエンとラミス、2007;。ガンら 、2000ガンら 、2009)に、そのようなDIIなどの蛍光色素を、導入する遺伝子銃を使用しています。ここではテクニックを設定するときに役立つのはいいと悪い結果の典型的な画像と一緒に必要な各ステップの詳細な説明を提供しています。我々の経験では、いくつかの手順はDiOLISTICSの成功したアプリケーションの重要な証明。これらの考慮事項は、DIIでコーティングされた弾丸の品質、固定剤曝露の程度、およびインキュベーションのソリューションで使用される界面活性剤の濃度が含まれています。一般的な問題に関するヒントと解決方法が提供されています。
これは、幅広い年齢層に複数の動物種に適用できる汎用ラベリング技術です。彼らは、蛍光遺伝子の発現に依存しているため、若い動物からの準備に制限、あるいはマウスに制限されている他の蛍光標識技術とは異なり、DiOLISTICの標識は、すべての年齢、種や遺伝子型の動物に適用することができますし、それと組み合わせて使用することができます細胞の特定の亜集団を識別するための免疫染色。ここでは、成体マウスと樹状突起分枝と樹状突起スパイン形態を定量化する目的を持つ成人の非ヒト霊長類の脳スライスの神経細胞をラベルするDiOLISTICSの使用方法を示しています。
DiOLISTICラベリングは、それが多様な種から、幅広い年齢層に、そして組織に組織切片に適用することができるため、蛍光標識する細胞のための、最も汎用性の高い技術の一つである(また、ガンらを参照して新鮮なまたはからの固定液で灌流動物を取得。、2009)。プロセスは、1〜2日かかるので、比較的高速であり、そのような免疫染色(Lee ら 、2006)など、他の多くの古典的なラベリングの手法と組み合わせることができます。これらは、親油性膜の整合性を構成すると色素が細胞外に漏出してしまうので、特別な注意は、固定およびインキュベーションのソリューションで高い界面活性剤濃度を使用するよりも避けるために注意を払う必要があります。抗体の浸透は、トリトンX – 100(Lee ら 、2006)、ならびにインキュベーション溶液中のジギトニンまたはサポニン(松林ら 、2008)の低濃度で促進することができる。この手法に適用できるいくつかの修正は、ガンら (2000)または抗体の曝露(ニーリーら 、2009)の長さと種類を変更することで説明され、複数の色素を持つ弾丸の使用を含む。
伝統的に、DIIは、脳内の神経突起をトレースするために使用されています。 DiOLISTICラベリングは、細胞の形態を調べるために有用な方法を記述することによって、そのアプリケーションを拡張します。神経形態は大きな関心のために脳と細胞の形状は、神経系の神経集団の機能の多様性に反映させるかもしれないという憶測に見られるような大きな多様性である。その一例としては、哺乳類の神経系のディスプレイの小さな突起の多くのニューロンはグルタミン酸作動性シナプスの部位である樹状突起と呼ばれるという事実です。この方法では、セル上にグルタミン酸作動性シナプスの密度は、本明細書に記載の標識法を用いて測定することができる樹状突起棘の密度、に相関させることができる。さらに、そのような樹状突起全体の長さ、分岐パターン、樹状突起棘の形状や密度などの他の形態学的パラメータが定量化し、研究することができる。
それは、より高い分解能共焦点イメージングを可能にするため、明視野顕微鏡(例えばゴルジ染色)に依存する従来の技法と比較すると、神経形態を研究するための蛍光標識の使用は、多くの利点があります。樹状突起棘の密度や形態を測定することを目的とした実験では、蛍光体としてDIIを使用してのもう一つの利点は、その親油性の特性です。 DIIは、細胞膜に分割し、神経突起と樹状突起の明確に定義された概要を提供します。ほとんどの樹状突起棘(1未満フェムトリットル)の少量を考えると、膜の染色は、より効率的であり、細胞質染色よりも小さく、細い突起のよりよい視覚化することができます。
The authors have nothing to disclose.
我々は、彼らの共焦点顕微鏡にアクセスするためのテクニックと博士ふみ小野研究室の初期設定中にそれらの援助のためにマイケルフェデーとテレルホロウェイに感謝します。この研究は、NIAAAとNINDSの学内プログラムを通じて国立衛生研究所によって資金を供給された。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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1-1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI) | Invitrogen | D-282 | ||
Methylene chloride | Mallinckrodt Chemicals | H485-06 | ||
Tungsten beads | Bio-Rad | 165-2269 | 1.7 μm diameter | |
Polyvinylpyrrolidone | Calbiochem | 529504 | ||
Tefzel bullet tubing | Bio-Rad | 165-2441 | ||
Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | ||
Helios Gene Gun | Bio-Rad | 165-2431 | ||
Isopore membrane filter paper | Millipore | TSTP02500 | 3.0 μm pore size | |
ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | ||
Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | (16% w/v) |