Summary
هذا البروتوكول يستخدم لهدم مقايسة لتحديد مستويات GTPase RhoC نشطة داخل الخلايا.
Abstract
RhoC GTPase وقد تماثل 91 ٪ إلى GTPase RhoA. بسبب انتشاره في الخلايا ، وقد وضعت العديد من الكواشف والتقنيات اللازمة لGTPase RhoA. ومع ذلك ، أعرب RhoC GTPase في خلايا السرطان النقيلي عند مستويات منخفضة نسبيا. لذا ، وضعت بعض الكواشف RhoC محددة. وقد تكيفت لدينا فحص للكشف عن التنشيط رو GTPase RhoC. هذا الأسلوب يستخدم لضريبة السلع والخدمات ، رو الانصهار المجال ملزمة بالانسحاب من البروتين النشط RhoC GTPase. بالإضافة إلى ذلك ، يمكننا أن محصول البروتين الكلي في بداية الفحص لتحديد مستويات من المجموع (GTP الناتج المحلي الإجمالي وملزمة) RhoC GTPase. وهذا يسمح لتحديد GTPase RhoC النشطة مقابل الإجمالي في الخلية. وقد وضعت العديد من الإصدارات التجارية من هذا الإجراء ومع ذلك ، هي الأمثل مجموعات تجارية لGTPase RhoA وعادة لا تعمل بشكل جيد لGTPase RhoC. تم تعديل أجزاء من الفحص وكذلك وضع الضد RhoC محددة.
Protocol
1. إعداد GST الانصهار بروتين
- مصنوعة من مخزونات الجلسرين JM109 البكتيريا المختصة التي تحتوي على أول محطة N - 90 الأحماض الأمينية في المجال rhotekin ملزمة رو (RBD) subcloned في ناقلات pGEX3x BamH1/EcoR1.
لا بد منه لضمان كفاءة عالية يتم تنفيذ الخطوات التالية للحصول على كل تجربة. في تجربتنا ، التي أعدت حديثا GST - RBD هو المفتاح لمقايسة GTPase التنشيط قوية ودقيقة. - إضافة 50 ميكرولتر (تقريبية ، لا الذوبان) من الأسهم الجلسرين إلى 50 مل أمبير LB وتنمو 37 درجة مئوية خلال الليل مع اهتزاز.
- تمييع 01:10 LB في 500 مل أمبير وتنمو لمدة 1 ساعة.
- حمل GST إنتاج البروتين بنسبة 0.1 ملي IPTG لمدة 2 ساعة.
- توزع بالتساوي في زجاجات الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي ، Sorval الدوار في 5000 دورة في الدقيقة GSA3 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
- Resuspend بيليه في زجاجات الطرد المركزي ، و 10 مل من تحلل العازلة *.
* الاحتياطي تحلل الجرثومي : السكروز 20 ٪ ، 10 ٪ الجلسرين ، و 50 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 0.2 ملم نا 2 S 2 O 5 ، 2 مم MgCl 2 ، 2 DTT ملم ، إضافة PMSF الطازجة ، بينزاميد ، وأبروتينين leupeptin. - يصوتن 2-3 دقيقة (وهذا يعتمد على نوع sonicator. نستخدم سونيك فيشر Dismembranator موديل 500 علامة وضعت في 6 و 50 ٪ دورة).
- أجهزة الطرد المركزي ، Sorvall SS34 ، 20 دقيقة 10000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. عند هذه النقطة يمكن أن يتخذ من قسامة الصغيرة ويديرها SDS - PAGE. يمكن أن يكون coomassie الجل الملون والفرقة واضحة وينبغي على 46 كيلو دالتون.
- طاف إزالة وإضافة 1 مل من 50 ٪ glutatione - 4B Sepharose الطين.
- احتضان لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية مع التناوب. تغسل 3 مرات مع تحلل العازلة.
- Resuspend حبات الطين GST-RBD/glutatione-Sepharose إلى 50 ٪ (حوالي 1 مل) مع GST الأسماك العازلة **. ** GST السمك الاحتياطي : الجلسرين 10 ٪ و 50 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 7،4 ، و 100 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 1 ٪ NP - 4 ، 2 مم MgCl 2 ، إضافة PMSF الطازجة ، بينزاميد ، وأبروتينين leupeptin
2. GST الانصهار هدم مقايسة
- استخدام 50-10 × 10 6 خلية / مقايسة
- غسل خلايا مرة واحدة في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة ، والحفاظ على لوحات على الجليد (نستخدم صحن الزجاج المسطح مملوءة الجليد) وليز مع 0.5 العازلة GST الأسماك مل.
- احتضان 5 دقائق على الجليد ، وخلايا الحصاد باستخدام المزيل شرطي المطاط أو شقة ، ونقل إلى microfuge الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي 20000 دورة في الدقيقة 5 دقائق على 4 درجات مئوية.
- طاف لنقل أنبوب microfuge الطازجة. تأخذ 50 ميكرولتر لتحديد رو الكلي (أي الناتج المحلي الإجمالي GTP + ملزمة).
- إضافة 0.5 مل GST-RBD/glutatione-Sepharose الخرز واحتضان عند 4 درجة مئوية ، بين عشية وضحاها مع التناوب.
- يغسل مع 6X GST الأسماك العازلة.
- Resuspend الخرز في 40 ميكرولتر العازلة عينة - 2X Laemelli
عند هذه النقطة يجب أن يتم تحديد تركيز البروتين الكلي قسامة رو المتخذة في 2.4 و 30 ميكروغرام أعدت ليتم تشغيلها على هلام مع العينة التنشيط المقابلة. - عينات يغلي عند 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، طرد المركزي لفترة وجيزة ، واتخاذ طاف (أي تجنب الخرز) تحميل وتشغيل المعامل على 12 ٪ جيد 40-20 SDS - PAGE هلام.
- تشغيل هلام في أي أعلى من 150 فولت ، ونقل إلى استخدام غشاء Towbin العازلة الحالية والمستمرة من 100 دبليو.
- كتلة الغشاء بمحلول الحليب / TBST 5 ٪ ، والتحقيق مع RhoC - specfic الأضداد.
3. ممثل النتائج
وينبغي أن تنتج نتائج جيدة في شريط واحد حوالي 22 كيلو دالتون. النتائج السيئة تنتج نطاقات متعددة أو خلفية عالية. هذا يدل على تدهور البروتين ، وغسل العينات غير مكتملة أو استخدام القديمة GST - RBD.
الشكل 1. تظهر ثلاثة خطوط منفصلة خلية التعبير عن مستويات مختلفة من GTPase RhoC لإظهار مستويات منخفضة من RhoC نشطة وإجمالا ، مستويات عالية من RhoC النشط والكلي أو RhoC لا. جردت ثم وصمة عار reprobed مع أجسام مضادة لهذا الجين أكتين منزل حفظ لتكون بمثابة سيطرة التحميل للبروتين RhoC الإجمالي.
الشكل 2. نطاقات متعددة أو خلفية نتائج عالية من البروتين التدهور ، وغسل العينات غير مكتملة أو استخدام القديمة GST - RBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوة الأكثر أهمية من هذا الإجراء هو الجيل الجديد من GST - RBD. عدم إيلاء اهتمام وثيق لهذه الخطوة هو السبب الرئيسي للفشل. جميع الخطوات ، من جيل لGST - RBD (1.2) إلى حضانة بين عشية وضحاها مع lysate الخلية (2.5) ، ينبغي أن يتم في يوم واحد. خطوة أخرى حاسمة هي التأكد من ان هناك ما يكفي من الخلايا لانتاج lysates الخلية. هذا الأمر أهمية خاصة عند النظر في GTPase RhoC ، والتي تميل إلى أن تكون موجودة في مستويات منخفضة في الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
قسم الدفاع W81XWH - 05 - 1-0005 ، W81XWH - 06 - 1-0495 ، W81XWH - 08-1 0029 وW81XWH - 08-1 - 0356
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gluthione-sepharose 4B beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
| Criterion 4-20% Tris-HCl gels | Bio-Rad | 345-0032 |
References
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype. Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells. Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).
- Golen, K. L. van Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor. Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).
- Golen, K. L. van Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer. Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).
- Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility. Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).
- Hall, C. L. Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase. Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).
- Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis. Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).
- van Golen, K. L. CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac. J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).
- Chatterjee, M., van Golen, K. L. Int J Cancer. , Forthcoming (2010).
- Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior. J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).
