Summary
该协议利用上拉下来检测,以确定细胞内的活动中RhoC GTP酶的水平。
Abstract
RhoC的GTP酶有91%的同源性GTP酶RhoA的。由于其在细胞中的患病率,许多试剂和GTP酶RhoA的技术已经开发出来。然而,RhoC的GTP酶表达的转移性癌细胞处于较低水平。因此,数RhoC的特定试剂已经开发出来。我们已经适应了一个Rho的激活检测,检测RhoC的GTP酶。这种技术利用商品及服务税的Rho结合结构域融合蛋白拉出积极RhoC的GTP酶。此外,我们可以在检测开始收获总蛋白,以确定总水平(GTP和GDP结合)RhoC的GTP酶。这使得主动与总RhoC的GTP酶在细胞中的决心。此过程中的几个商业版本,但是已经开发,商业试剂盒优化GTP酶RhoA的,通常不工作中RhoC GTP酶。检测的部分已被修改,以及作为一个RhoC的特异性抗体的发展。
Protocol
1。准备GST融合蛋白
- JM109感受态细菌,包含第一的N -端90个氨基酸的rhotekin Rho的结合域(RBD)的进入BamH1/EcoR1 pGEX3x载体亚克隆酸甘油。
为了确保高效率,必须执行以下步骤,每个实验。根据我们的经验,新鲜的GST - RBD的是一个强大的和准确的GTP酶激活检测的关键。 - 加入50微升(近似的,没有解冻)甘油50毫升的LB放大器和成长37℃摇动过夜。
- 1:10稀释500毫升LB放大器,并成长为1小时
- 0.1 mM的IPTG的2小时诱导的GST -蛋白生产。
- 离心瓶,离心,Sorval GSA3转子均匀分布在5000 RPM的4 ° C下20分钟。
- 离心瓶,10 mL裂解缓冲液中的悬浮颗粒*。
*细菌细胞裂解液:20%的蔗糖,10%甘油,50毫米的Tris pH值8.0,0.2毫米的Na 2 S 2 O 5,2毫米,2毫米的DTT MgCl 2的,添加新鲜的PMSF,苯甲酰胺,抑肽酶和亮肽素。 - 超声2-3分钟(这取决于sonicator类型,我们使用一个菲舍尔声波Dismembranator 500型商标6集,50%的周期)。
- 离心机,Sorvall SS34,20分钟10,000转,4 ° C。此时可以采取的一个小等分,并经SDS - PAGE运行。凝胶可以考马斯染色,应在46 kDa的乐队明显。
- 去除上清液,加入1毫升50%glutatione琼脂糖4B浆。
- 孵育30分钟,在4 °旋转彗星。裂解缓冲液洗3次。
- 重悬GST-RBD/glutatione-Sepharose珠50%的浆料(约1毫升),GST鱼缓冲区** ** GST鱼缓冲液:10%甘油,50毫米的Tris pH值7.4,氯化钠100毫米,1%NP - 4,2毫米氯化镁2,添加新鲜的PMSF,苯甲酰胺,抑肽酶和亮肽素
2。 GST融合下拉检测
- 使用5-10 × 10 6细胞/检测
- 洗涤细胞一次在冰冷的PBS,保持冰板(我们使用平面的玻璃皿盛满冰块)和裂解0.5毫升GST鱼缓冲区。
- 在冰上孵育5分钟,收获细胞,用橡胶警察或平刮板,转移到离心管和离心机20,000 RPM 5分钟,在4 ° C。
- 上清转移到一个新的离心管。取50μL,以确定总的Rho(即国内生产总值+ GTP的约束)。
- 加入0.5毫升GST-RBD/glutatione-Sepharose珠,并在4 ° C孵育,用旋转过夜。
- 洗与GST鱼缓冲区的6倍。
- 在40μL2X - Laemelli样品缓冲液重悬珠
此时浓度的确定应采取的总的Rho蛋白在2.4等分和30微克准备在凝胶上运行相应的激活范例。 - 煮沸样品在90 ° C为5分钟,离心,取上清液(即避免珠)负载和12个4-20%梯度SDS - PAGE凝胶上运行。
- 运行在不高于150伏凝胶转移到膜的使用Towbin缓冲区和常量100 W
- 座与5%的奶粉/ TBST解决方案和探头中RhoC - specfic抗体的膜。
3。代表性的成果
良好的效果,产生约22 kDa的单波段。坏的结果产生多个频段或高背景。这是蛋白质的降解,不完整的样品洗涤或使用旧GST - RBD的指示。
图1显示三个独立的细胞株,表达RhoC的GTP酶的不同层次表现出积极和总RhoC的高层次,积极和总RhoC的或没有RhoC的水平低。然后剥离印迹和看家基因肌动蛋白的抗体,作为一个总RhoC蛋白的装载的控制reprobed。
图2多个频段或高蛋白质的降解,不完整的样本的洗涤或使用旧GST - RBD的背景。
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Discussion
该过程最关键的一步,是新鲜的GST - RBD的一代。密切关注到了这一步的失败是失败的主要原因。所有步骤,从GST - RBD的一代(1.2)孵育过夜的细胞裂解液(2.5),应在一天内完成。另一个关键的一步就是让某些有足够的细胞产生的细胞裂解液。这是在RhoC的GTP酶,它往往是在细胞水平低时,具有特别重要的意义。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
国防部部W81XWH - 05 - 1 - 0005,W81XWH - 06 - 1 - 0495,W81XWH - 08 - 1 - 0029和W81XWH - 08 - 1 - 0356
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Gluthione-sepharose 4B beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
Criterion 4-20% Tris-HCl gels | Bio-Rad | 345-0032 |
References
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