Summary
Questo protocollo utilizza un pull down di analisi per determinare i livelli di attivo GTPasi RhoC all'interno delle cellule.
Abstract
RhoC GTPasi ha il 91% di omologia RhoA GTPasi. A causa della sua diffusione nelle cellule, reagenti e tecniche per molti RhoA GTPasi sono stati sviluppati. Tuttavia, RhoC GTPasi è espressa nelle cellule tumorali metastatiche a livelli relativamente bassi. Quindi, pochi RhoC reagenti specifici sono stati sviluppati. Abbiamo adattato un test per rilevare l'attivazione Rho GTPasi RhoC. Questa tecnica utilizza un GST-Rho legame proteina di fusione del dominio a tirare fuori attivo GTPasi RhoC. Inoltre, siamo in grado di raccogliere proteine totali all'inizio del test per determinare i livelli di totale (GTP e PIL legato) GTPasi RhoC. Questo permette la determinazione di principi attivi rispetto al totale delle GTPasi RhoC nella cella. Diverse versioni commerciali di questa procedura sono stati sviluppati tuttavia, i kit commerciali sono ottimizzati per RhoA GTPasi e di solito non funzionano bene per RhoC GTPasi. Parti del test sono stati modificati, nonché lo sviluppo di una RhoC-anticorpo specifico.
Protocol
1. Preparare GST-fusione delle proteine
- Le scorte di glicerolo di batteri competenti JM109 contenenti il primo N-terminale di 90 amminoacidi di Rho rhotekin dominio di legame (RBD) subcloned nel pGEX3x BamH1/EcoR1 vettore sono fatti.
Al fine di garantire alta efficienza Le seguenti operazioni devono essere eseguite per ogni esperimento. Nella nostra esperienza, preparati al momento GST-RBD è la chiave per un test GTPasi robusto e preciso di attivazione. - Aggiungere 50 microlitri (approssimativo, senza scongelare) di brodo glicerolo a 50 mL di amplificatore LB e far crescere a 37 ° C durante la notte con agitazione.
- Diluire 1:10 in 500 ml LB-amp e crescere per 1 h.
- Indurre GST-produzione di proteine con 0,1 mM IPTG per 2 ore.
- Distribuire uniformemente in bottiglie da centrifuga e centrifugare, Sorval GSA3 rotore a 5000 giri 4 ° C per 20 min.
- Risospendere le sfere in bottiglie di centrifuga, 10 ml di tampone di lisi *.
* Buffer di lisi batterica: 20% di saccarosio, 10% glicerolo, 50 mM Tris pH 8.0, 0,2 mM Na 2 S 2 O 5, 2 mM MgCl 2, 2 mM DTT, Aggiungi fresca PMSF, benzamide, aprotinina e leupeptina. - Sonicare 2-3 minuti (dipende dal tipo di ultrasuoni. Usiamo un Fischer di Sonic Dismembranator modello 500 fissato a segno 6, ciclo 50%).
- Centrifuga, Sorvall SS34, 20 min 10.000 rpm a 4 ° C. A questo punto una piccola aliquota può essere estratto e gestito da SDS-PAGE. Il gel può essere colorato Coomassie e una band dovrebbe essere evidente a 46 kDa.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di 50% di glutatione-Sepharose liquami 4B.
- Incubare per 30 minuti a 4 ° C con rotazione. Lavare 3 volte con tampone di lisi.
- Risospendere le sfere GST-RBD/glutatione-Sepharose ad un impasto 50% (circa 1 mL) con GST-pesce tampone **. ** GST-Fish Buffer: 10% glicerolo, 50 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 1% NP-4, 2 mM MgCl 2, Aggiungere fresco PMSF, benzamide, aprotinina e leupeptina
2. Fusione GST-pull down assay
- Usa 5-10 x 10 6 cellule / test
- Lavare le cellule una volta nel ghiaccio PBS freddo, tenere le piastre in ghiaccio (usiamo un piatto di vetro piano riempito di ghiaccio) e lisare con 0,5 ml di GST-pesce buffer.
- Incubare 5 minuti in ghiaccio, le cellule raccolta con un poliziotto in gomma o scrapper piatto, trasferimento in microcentrifuga tubo e centrifugare 20.000 rpm 5 minuti a 4 ° C.
- Trasferire il surnatante in una provetta per microcentrifuga fresca. Prendere 50 microlitri per determinare totale Rho (cioè il PIL + GTP legato).
- Aggiungere 0,5 ml di perline GST-RBD/glutatione-Sepharose e incubare a 4 ° C, durante la notte con la rotazione.
- Lavare 6x con GST-pesce buffer.
- Perline Risospendere in 40 microlitri 2x-Laemelli tampone campione
A questo punto la concentrazione del totale aliquota proteina Rho preso in 2.4 deve essere determinata e 30 mcg pronto per essere eseguito sul gel con il campione di attivazione corrispondenti. - Campioni bollire a 90 ° C per 5 minuti, centrifugare brevemente e prendere surnatante (cioè evitare le perline), caricare ed eseguire su un 12-ben pendenza 4-20% SDS-PAGE gel.
- Esegui gel senza tensione superiore a 150, il trasferimento alla membrana utilizzando tampone Towbin e costante corrente di 100 W.
- Blocco della membrana con 5% di latte / TBST soluzione e sonda con RhoC-specfic anticorpi.
3. Rappresentante Risultati
Buoni risultati dovrebbero produrre una singola banda di circa 22 kDa. Cattivi risultati producono bande multiple o fondo elevato. Questo è indicativo di degradazione delle proteine, lavaggio incompleta di campioni o l'utilizzo di vecchi GST-RBD.
Figura 1. Tre linee di cellule distinte che esprimono diversi livelli di RhoC GTPasi sono mostrati per dimostrare bassi livelli di RhoC attivo e totale, alti livelli di RhoC attivo e totale o nessuna RhoC. La macchia è stato poi spogliato e reprobed con un anticorpo alla actina house keeping gene per servire come un controllo di carico per la proteina RhoC totale.
Figura 2. Bande multiple o risultati di elevato background dalla degradazione delle proteine, lavaggio incompleto dei campioni o l'uso di vecchie GST-RBD.
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Discussion
La fase più critica della procedura è la generazione di nuove GST-RBD. Il mancato prestare molta attenzione a questo passo è motivo principale per il fallimento. Tutte le fasi, dalla generazione del GST-RBD (1,2) per la notte di incubazione con il lisato cellulare (2,5), dovrebbe essere fatto in un solo giorno. Un altro passo fondamentale è quello di rendere certo che ci sono cellule sufficienti per produrre la lisati cellulari. Questo è di particolare importanza quando si guarda RhoC GTPasi, che tende ad essere presente a livelli bassi nella cella.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Dipartimento della Difesa W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 e W81XWH-08-1-0356
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gluthione-sepharose 4B beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
| Criterion 4-20% Tris-HCl gels | Bio-Rad | 345-0032 |
References
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype. Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells. Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).
- Golen, K. L. van Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor. Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).
- Golen, K. L. van Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer. Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).
- Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility. Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).
- Hall, C. L. Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase. Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).
- Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis. Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).
- van Golen, K. L. CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac. J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).
- Chatterjee, M., van Golen, K. L. Int J Cancer. , Forthcoming (2010).
- Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior. J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).
