Summary
يتم استخدام مزيج من ثلاثة واحد ليزر نابض قصيرة الطول الموجي لتوليد متماسكة لمكافحة ستوكس رامان نثر (السيارات) والسيارات ، مضاعفة الرنانة (DR - CARS). الفرق بين هذه الإشارات يوفر زيادة في الحساسية للخلاف من الصعب اكتشاف إشارات رامان متماسكة ، مما يتيح تصوير الذاريات رامان ضعيفة.
Abstract
شهدت تماسكا تقنيات التصوير رامان زيادة كبيرة في النشاط على مدى العقد الماضي بسبب وعودهم لتمكين التسمية خالية التصوير الضوئي مع خصوصية عالية الجزيئية 1. حساسية هذه التقنيات ، ولكن ، العديد من الطلبات من حيث الحجم أضعف من مضان ، تتطلب ملي المولي 1،2 تركيزات الجزيئية. هنا ، نحن تصف تقنية يمكن المساعدة في الكشف عن تركيزات منخفضة من ضعف أو رامان الجزيئات النشطة عن طريق تضخيم الإشارة مع ذلك تم الحصول عليها من الذاريات رامان قوية أو وفيرة. تفاعل الليزر نابض قصيرة في عينة بيولوجية يولد مجموعة متنوعة من متماسكة اشارات تشتت رامان ، كل منها تحمل فريدة عن المعلومات الكيميائية العينة. عادة ، يتم استخدام واحد فقط من هذه الإشارات ، على سبيل المثال المتماسك رامان نثر المضادة للستوكس (السيارات) ، لتوليد صورة بينما يتم تجاهل الآخرين. ومع ذلك ، عندما يتم تجميع هذه الإشارات الأخرى ، بما في ذلك 3 ألوان السيارات وأربع موجة خلط (FWM) ، وبالمقارنة مع إشارة للسيارات ، يمكن استخراجها من الصعب على خلاف ذلك للكشف عن المعلومات 3. على سبيل المثال ، السيارات ، مضاعفة الرنانة (DR - CARS) هو نتيجة للتداخل البناء بين إشارتين الرنانة 4. نحن لشرح كيفية ضبط للأشعة الليزر الثلاثة المطلوبة لإنتاج السيارات DR - إشارات إلى 2845 سم -1 الاهتزاز تمتد CH في الدهون والاهتزاز 2120 سم -1 CD تمتد من جزيء deuterated (السكريات deuterated مثل الأحماض الدهنية ، الخ.) يمكن استخدامها لتحقيق كل من الأصداء رامان في وقت واحد. في ظل هذه الظروف ، بالإضافة إلى إشارات السيارات من كل الرنين ، مجتمعة DR - CARS إشارة التحقيق ولدت أيضا على حد سواء. نحن لشرح كيفية اكتشاف الفرق بين إشارة DR - السيارات وتضخيم إشارة من الاهتزاز وفيرة لجزيء يمكن استخدامه لتعزيز حساسية لضعف الإشارة. نظهر أيضا أن هذا النهج يمتد حتى إلى التطبيقات التي يتم إنشاؤها على حد سواء اشارات من جزيئات مختلفة ، مثل أن استخدام مثل إشارة قوية من رامان مذيب يمكن أن تعزز إشارة ضعيفة رامان لتمييع المذاب.
Protocol
1. جيل من السيارات وإشارات DR - CARS
من أجل توليد السيارات وDR - السيارات إشارات في نفس الوقت ، هناك حاجة إلى ثلاث الانضباطي ومتزامنة قصيرة ليزر نابض المصادر.
- للحصول على ثلاثة نبضات متزامنة نبدأ مع ليزر واحد W 10 (PicoTrain ، HighQ ليزر ، وشركة). هذا الطول الموجي ليزر لديه ثابتة من 1064 نانومتر ، ويبلغ طوله نبض ثابت PS 7 ، ومعدل التكرار ثابتة من 76 ميغاهرتز.
- باستخدام سلسلة من نصف موجة لوحات والاستقطاب شعاع التقسيم مكعبات يتم تقسيم الحزم إلى ثلاثة أجزاء. صفيحة نصف موجة جنبا إلى جنب مع مكعب شعاع التقسيم يتيح لنا استقطاب لضبط كمية الطاقة في كل مكون من الحزم دون تغيير اتجاهه. عادة ، يتم ضبط شعاعين إلى ~ 4.5 واط لكل منهما ، والثالث يحتوي على شعاع المتبقية دبليو 1
- وتوجه بعد ذلك شعاعين الطاقة العالية في دولتين مستقلتين المذبذبات البارامترية الضوئية (OPO ، وأفانتي ، القرد شركة محدودة ، برلين ، ألمانيا). وتردد الفرق OPO الجيل استخدامها لتحويل الفوتون طاقة أعلى إلى قسمين الفوتونات انخفاض الطاقة مع موجات مختلفة. عن طريق التحكم في درجة الحرارة من الكريستال المستخدمة لتحقيق هذا الغرض ، ويمكن التحكم في الطول الموجي للفوتونات الناتجة إلى داخل 0،1 نانومتر. بواسطة التردد مضاعفة هذه الإشارات ، ويمكن الآن ليزر مع طول موجة ثابتة من 1064 نانومتر أن تتحول إلى أشعة الليزر التي يمكن ضبطها في أي مكان بين 780 نانومتر إلى 910 نانومتر. عن طريق ضخ OPO منفصلين مع نفس المصدر 1064 نانومتر ، ونحن الحصول على اثنين من مصادر مستقلة الانضباطي الليزر التي يتم مزامنتها تلقائيا ليزر لدينا مضخة الأصلي.
- يتم توجيه الثالث (السلطة أدنى) شعاع من الليزر 1064 نانومتر حول مضخة لOPO من قبل مجموعة من المرايا مزدوج اللون بحيث يمكن إعادة تجميع كل الحزم الثلاث (2 من OPOS (1) ، من الليزر مضخة) في وقت لاحق. ويجب من أجل إنتاج بكفاءة متماسك الفوتونات إشارة رامان أن تتداخل النبضات معاد زمنيا ومكانيا على السواء. لأنه يحتوي على تجاويف OPO الطوق ، كل نبضة ليزر يسمح بالمرور عبر عدة مرات الكريستال ، والحزم المرسلة من خلال السفر لمسافة OPO اضافية مما أدى إلى تأخير كبير نسبة إلى شعاع مضخة الأصلي. يجب أن تعوض عن هذه المسافة مع شعاع الثالثة إدخال المرايا خارج تلك القوة هذا التردد لقطع المسافة نفسها الآخران قبل معاد أنهم باستخدام المرايا مزدوج اللون.
- من أجل توفير الضبط الدقيق للطول مسار كل شعاع يسافر مراحل تأخير للتعديل ، وذلك باستخدام retroreflectors المنشور ، يتم إدخالها في كل مسار الشعاع.
- يتم إضافة مجموعة أخرى من نصف موجة لوحات والاستقطاب شعاع مكعبات التقسيم إلى كل شعاع للسماح لنا لضبط قوة كل شعاع بشكل مستقل دون التأثير على مدخلات لOPO.
- تستخدم المرايا مزدوج اللون من الجمع بين لأول مرة من الحزم في OPO يومين ثم مع شعاع نانومتر 1064. يجب توخي الحذر لضمان تتداخل الحزم على وجه التحديد (أي أنهم هم على خط ويكون الاختلاف مشابهة). ويمكن تحديد هذا التداخل من خلال مقارنة للأشعة على مقربة من (داخل بضعة سنتيمترات) ، وبعيدا عن المرآة (~ 1 م) مزدوج اللون.
- الفائدة من استخدام الليزر النبضي هو أن كل نبضة الطاقة يمكن أن يكون لها ذروة عالية في العينة ، مما يسمح لكفاءة توليد الإشارات رامان متماسكة ، مع الحفاظ على متوسط كثافة منخفضة. ويمكن لشدة ارتفاع متوسط الضرر العينة. ولذلك من أجل السيطرة على مزيد من كثافة المتوسط دون التضحية الطاقة الذروة ، يتم إرسال الحزم الثلاثة مجتمعة من خلال المغير الكهربائية الضوئية (خلية Pockel وConOptics) يعمل كما منتقي النبض ، والذي يتيح لنا لضبط معدل تكرار البقول التي التوصل إلى عينة لدينا ، وبالتالي فإن كثافة المتوسط.
- تقترن ثم أشعة الليزر دمجها مع مجهر مقلوب هدفا NA عالية. والهدف من ذلك هو عادة المياه X 60 عدسة موضوعية مع فتحة العددية (NA) 1.2 الذي تم تصحيحه لانحراف لوني عبر مجموعة من tunability من OPO لدينا وشعاع نانومتر 1064. وضيق التركيز التي تم إنشاؤها بواسطة عدسة عالية الهدف NA يسمح للجيل أكفأ من الإشارات رامان متماسكة على مقياس ميكرون.
- يتم توسيع الحزم معا من أجل فعم الظهر منفذ الهدف المجهر. بواسطة الملئ الجزء الخلفي من الهدف المجهر يمكننا تحقيق أفضل الظروف ، وبالتالي التركيز على أفضل قرار المكانية في نظام المجهر لدينا.
- هي التي شنت على عدسة المجهر الهدف في موقعنا في مرحلة بيزو XYZ الذي يتيح لنا الحصول على الصور النقطية بواسطة مسح الحزم عبر العينة ، على غرار شعاع المجاهر المسح مبائر التجارية.
2. استخدام ليزر نابض ثلاثة قصيرة
استخدام ثلاث نتائج ليزر نابض قصيرة في إنتاج السيارات إشارات عدة ، من مختلف جombinations اثنين من أشعة الليزر ، وكذلك السيارات 3 اللون وDR - FWM إشارات من الليزر مزيج من كل ثلاثة.
- يمكن للموجات من الاشارات تكمن طيفيا قريبة من بعضها البعض. عند ظهور إشارات قريبة من بعضها البعض ويمكن أن يكون من الصعب فصلها عن التحليل باستخدام مرشحات الثابتة ممر الموجة الطول الموجي والمرايا مزدوج اللون. لهذا السبب يتم تمرير توقعاتنا الى التصوير الطيفي (SpectraPro 2300i ، أكتون البحوث) التي تعمل أيضا بمثابة مستوحد اللون فعالة لفصل مكانيا إشارات على موجات مختلفة.
- مرآة الوجه دفعتها إلكترونيا داخل مطياف في موقف خفضت يرسل إشارة إلى الخلفية المضاءة العميقة استنفاد المسؤول عن جانب الكاميرا (CCD) الجهاز الذي يوفر المعلومات الطيفية عبر طائفة بأكملها وإشارة تتيح لنا التعرف والاستفادة المثلى من مختلف متماسكة رامان الاشارات.
- لتحديد إشارة التي نود أن نقوم بتدوير صورة ببساطة صريف داخل الطيف ، وذلك باستخدام بائع الموردة من السيطرة والاستحواذ البيانات والبرمجيات (WinSpec ، آلات برينستون) ، إلى مركز ذروة الفائدة على كاميرا CCD ومن ثم تغيير موقف المرآة انعكاس لإعادة توجيه هذه إشارة إلى منفذ الخروج الثاني الذي تم إرفاق الانهيار العد فوتون واحد الصور ديود (APD).
- عدسة الهدف هو ثم النقطية الممسوحة ضوئيا وتستخدم إشارات مسجل على APD لتوليد صورة من خلال عرض الفوتون العد معدل كل بكسل من خلال برنامج الحصول على البيانات (SymPhoTime ، Picoquant محدودة ، برلين ، ألمانيا).
- نكرر هذا الإجراء لتصوير كل إشارة المرجوة رامان متماسكة مما يسمح لنا بمقارنة الإشارات خلال تجهيز آخر.
3. تحضير العينة
ويجب من أجل الحصول على واضحة ، وصور استنساخه أن تؤخذ بعض العناية في إعداد العينة.
- عادة ما يتم إعداد العينات في ~ 150 ميكرون coverslips الزجاج السميك. coverslips هذه هي رقيقة بما يكفي للسماح للتصوير عالية الدقة مع أهداف NA 1.2 التي تستخدم عادة.
- يمكن محاصرة البصرية للأجسام عازلة تحدث عندما يكون هناك ضوء الليزر هو diffracted من خلال الكائنات الشفافة الصغيرة. استخدام تركز بإحكام ، قوة ذروة عالية ، ويمكن أشعة ليزر نابض قصيرة ثم سحب خلايا صغيرة أو البكتيريا على طول ، مما أدى إلى عدم وضوح الصور أو ملطخة. من أجل تجنب هذا قد يكون من الضروري لشل حركة العينة على سطح من الزجاج ساترة لأول مرة من خلال تطبيق طبقة رقيقة من بولي - L - يسين بواسطة طلاء زيادة ونقصان.
- ويمكن للخلايا أن تستخدم في الثقافة الأطباق الزجاجية التي تسمح للثقافة أسفل للتصوير من دون الحاجة لفصل الخلايا من أطباقهم نمو الخلايا الثقافة.
- للتظاهر في هذه المساهمة لأول مرة ونحن ودائع ثابتة جيم الفورمالديهايد ايليجانس الدودة السلكية على الزجاج الانزلاق الغطاء.
- ثم تضاف 20 قطرات من 5 ميكرولتر M حل الجلوكوز deuterated لدودة. الحل يوفر الجلوكوز deuterated فريدة وقوية التوقيع الخلفية رامان.
4. تحليل عينة
يجب أن تتخذ من أجل الاستفادة بشكل صحيح من تأثير مضاعف ، وتعزيز الرنانة يكون معروفا أطياف رامان كل من المواد رامان - الرنانة.
- بعد الانتهاء من إعداد نموذج على ساترة يتم تحليلها باستخدام المجهر متحد البؤر رامان ذات الصلة للحصول على الطيف رامان عفوية وتحديد القمم مناسبة.
- لأداء DR - السيارات نحدد مواقع الطيفية لوضع تمتد CH ، التي ترتبط عادة مع الدهون ، ووضع تمتد CD ، المرتبطة deuterated الجلوكوز ، ليكون 2845 سم -1 و 2121 على التوالي سم -1.
- ويتحقق تشتت رامان تماسكا عندما يكون الفرق بين اثنين من تردد الليزر مباريات تواتر اهتزاز الجزيئية. بواسطة OPO one ضبط 817 نانومتر إلى أنه سوف سبر 2845 وضع الطول CH -1 عندما يقترن شعاع الليزر 1064 نانومتر ، وتوليف OPO الأخرى إلى 868 نانومتر انها ستبحث في 2121 سم -1 الذروة عندما يقترن شعاع نانومتر 1064 .
- بواسطة النقطية مسح العينة على المجهر سيارات يمكننا الآن ملاحظة ثلاث اشارات رامان متماسكة من الفائدة. من السيارات التي تحقق في إشارة CH تمتد الاهتزاز ، وهي إشارة للسيارات يحقق في وضع تمدد نزع السلاح ، وإشارة DR - CARS التحقيق على حد سواء.
- علينا تحديد كل الذروة كما هو موضح في القسم 2.3 و التقاط صورة على النحو المبين أعلاه.
5. معالجة الصور
استخراج معلومات إضافية استنادا إلى هذه الصور الثلاث الآن يتطلب بعض معالجة صورة بسيطة نسبيا.
- لا بد أولا من تطبيع الصور. يمكن أن تكون نظرية في التطبيع الذي حققته المحاسبية ليزر كثافة كل المشاركين في كل عملية توليد الإشارات. في الممارسة العملية ، ولكن هذا لا يعمل دائما ، ويرجع ذلك أساسا إلى الاستجابة الطيفية غير موحدةمن المرايا مزدوج اللون ، وكاشفات ، وحواجز شبكية.
- وهناك طريقة عملية لتطبيع تعتمد على حقيقة أن نسبة الدهون في المناطق التي تسيطر على إشارة نقية ، ونزع السلاح ينبغي أن بالرنين لا تسهم في أي من الإشارات. وبالمثل ، في مناطق من محلول الجلوكوز النقي ينبغي أن بالرنين CH لن يساهم في أي من الإشارات. ومع وضع هذا في الاعتبار ، ونحن تطبيع صورة DR - السيارات والسيارات التي تم الحصول عليها صورة بالرنين على CD من الحل الجلوكوز deuterated إلى المنطقة جيدا خارج C. ايليجانس الدودة التي ينبغي أن تبدي أي صدى CH.
- ثم نحدد منطقة داخل الديدان في صورة سيارات CH - الرنانة التي هي غنية في الدهون وتطبيع إلى المنطقة المقابلة في صورة DR - السيارات تطبيع. لهذا الأسلوب للعمل بشكل صحيح ونحن نفترض أن عميقة داخل هذه المنطقة لا الجلوكوز deuterated موجودا. هذا هو الافتراض منذ الدهون هي مسعور ، وسوف لا يختلط مع الحل.
- الآن ، وذلك بطرح تطبيع صورة سيارات CH - مدوية من صورة DR - السيارات تطبيع نحن مع اليسار مجرد إشارة CD - الرنانة تضخيمها.
- وبالمثل من خلال طرح صورة طبيعية للسيارات CD - مدوية من صورة DR - FWM تطبيع نحن مع اليسار CH - الرنانة مجرد تضخيم الإشارات.
6. ممثل النتائج
الشكل 1 : رسم تخطيطي لنظام DR - المجهري للسيارات كما هو موضح أعلاه.
الشكل 2 : صورة الابيض ضوء C. ايليجانس الدودة في محلول الغلوكوز deuterated تعد على ساترة الزجاج وجاهزة للتصوير.
الشكل 3 : الطيف رامان من حمض الأوليك تعديل (وهو حمض دهني غير مشبع) يتضمن تعديلا آلكاين (مجموعة الكربون الكربون الثلاثي السندات) والأصداء القوية في CH 2845 سم -1 والرنين آلكاين 2100 في كل من الطول و-1 معزولة تماما عن المنطقة البصمات (منطقة مكتظة بالسكان قمم) ، مما يجعلها مثالية لتصوير علامات رامان متماسكة.
الشكل 4 : الطيف نموذجي من إشارات رامان متماسكة ولدت عندما تتداخل الثلاثة القصيرة ، نابض الليزر داخل العينة والسهام إشارة إلى العملية (العمليات) المسؤولة عن كل إشارة ، التي تمثلها مخططات الطاقة. في المخططات المعروضة هنا تشير السهام متقطع الفوتونات من الليزر والتي OPO والسهام صلبة تشير إشارة الناتجة عن ذلك. خطوط أفقية قوية تدل على الطاقة من الاهتزاز رامان وإعطاء التمثيل البصري أنه في DR - السيارات ، والخلط نفسه الفوتونات المدخلات 3 تحقيقات وقت واحد اثنين الاهتزازات رامان مختلفة.
الشكل 5 : نتائج نموذجي من جيم التصوير ايليجانس باستخدام الديدان DR - السيارات والسيارات. استخدام الصف العلوي الإشارات الثلاثة المشار إليها في الشكل رقم 4 لصورة دودة في محلول الغلوكوز deuterated. في الصف الثاني وتطبيع مناسب وصور في الصف الثالث أنتجت الصور الفارق عن طريق طرح كل من صور السيارات من صورة DR - السيارات.
Discussion
رامان التحليل الطيفي والتصوير رامان المستندة إلى أدوات قوية الناشئة في مجال العلوم البيولوجية. حاليا ، هذا صحيح لا سيما بالنسبة للفي الجسم الحي والدراسة في المختبر من الأيض الخلوي والاضطرابات الأيضية في معالجة وتخزين الدهون. معظم الجزيئات الحيوية تحتوي على عدد كبير من سندات مماثلة ، الجزيئية في معظمها تقوم على الكربون ، بحيث أطياف رامان تم الحصول عليها من خلايا الكائنات الحية وعادة ما تكون الإلتواء المساهمات من الدهون والبروتينات والأحماض النووية ، والسكريات ، والدهون غير ذلك من السهل نسبيا لعزل من هذه الأطياف المعقدة ، وذلك بسبب ميلها لتشكيل قطرات كثيفة وطبقات ثنائية أو لأنها تحتوي على سلاسل طويلة مع عدد كبير من السندات CH الأليفاتية. قدرتنا على عزل بروتينات معينة ، والأحماض الأمينية ، والجيش الملكي النيبالي ، أو الحمض النووي داخل الخلايا البيئة المعقدة ، مع ذلك ، محدودة جدا. هذا صحيح بصفة خاصة إذا كانت هذه الجزيئات من الفائدة موجودة فقط في تركيزات ميكرومتر وما دونها. هنا ، والقدرة على تحقيق الاستفادة من ضعف رامان الأصداء التي أدخلت حديثا لدينا فرق التصوير DR - السيارات تقنية يوفر نهجا قوية لتحليل مجهري الكيميائي والتصوير. باعتراف الجميع ، والجزء الأكثر تعقيدا من هذا البروتوكول هو التوافق والتزامن لنظام ليزر. عندما تبدأ من الصفر ، وتزامن البقول ، وضمان أن يتم أي تداخل النبضات في الوقت المناسب على الرغم من أنها تأخذ مسارات مختلفة يمكن أن تيسره استخدام autocorrelator النبض. ويتحقق التداخل المكاني والزماني مرة واحدة والسيارات وDR - السيارات إشارات ينبغي كشفها بسهولة. ومع ذلك ، فإن المحاذاة الأول هو الغالب الخام ، مما أدى إلى إشارات ضعيفة. أفضل الممارسات لمواءمة هذا النظام بشكل جيد يهدف الى توليد إشارات ضعيفة في البداية ومن ثم لتحسين قوة الإشارة التي اللف برفق المرايا على طول كل المسار وضبط التداخل الزمني باستخدام مراحل تأخير. على الرغم من تحول أعمال مطياف / مستوحد اللون كما يربك فعالة جدا للضوء الغرفة يمكن تحقيق نتائج أنظف من خلال تشغيل النظام مع أضواء الغرفة قبالة والستائر أو أنابيب للحد من عدسة خلفية عرضه مصادر الضوء المختلفة الأخرى (مثل شاشات الكمبيوتر ، أضواء المؤشر ، المصابيح ، إلخ).
الإعداد لدينا خاصة ويستخدم الفوتون المفرد عد سيل الصور ديود (APD) للكشف عن وتستغرق وقتا ترتبط العد فوتون واحد (TCSPC) أجهزة للكشف عن 5. وهذا يمكننا من الكشف عن اشارات ضعيفة للغاية مع ضوضاء منخفضة نسبيا لكن جماعات كثيرة وجدت الصور المضاعف أنابيب (PMT) مع الحصول على فائدة متغير عند إجراء القياسات مماثلة. ميزة لPMT هو أنها توفر كسب متغير ويكون لها مجال الكشف عن أكبر بكثير مما يمكن تبسيط محاذاة كاشف. بالإضافة إلى ذلك ، يستخدم الإعداد لدينا مراحل بيزو لترجمة موضوعية من أجل تحقيق المسح شعاع. وميزة هذا هو أن لدينا القدرة على العودة الى أي بقعة داخل الصورة الممسوحة ضوئيا من قبل مع وجود درجة عالية من الدقة وأخذ قياسات إضافية بما في ذلك أطياف رامان عفوية. وكانت الجماعات الأخرى الناجحة باستخدام مرآة المجالس المسح الضوئي ، أو حتى كامل وحدات المسح مبائر مثل نظام FluoView أوليمبوس ، والذي يقدم التصوير أسرع بكثير ولكنها محدودة في قدرتها على العودة إلى مواقع على وجه التحديد التعسفي داخل صورة.
توليف ليزر لمطابقة الرنين رامان هو أيضا خطوة الحرجة التي قد تتطلب بعض التحسين. رغم أنه قد يكون معروفا القمم رامان أقصى ذروة الكثافة الطيفية التي تم الحصول عليها من DR - السيارات والسيارات لا تتوافق بالضرورة إلى أقصى ذروة رامان عفوية. هذا ومن المقرر أن تدخل جوهري من الإشارات التي تولدها أربع موجة خلط يؤدي إلى إشارة الخلفية غير الرنانة والسيارات ، الأمر الذي يشوه السيارات أطياف أطياف رامان النسبي للعفوية. ويمكن حساب الموقع الطيفية للذروة إشارة السيارات ، ولكن اتباع نهج أكثر واقعية هو توليف OPOS في عدة خطوات صغيرة الطيفية عبر الموقع المتوقعة من الرنين رامان. هذه العملية يجب أن تسفر عن الحد الأقصى واضحة. في الواقع ، لا بد لأكبر من الحساسية DR - FWM يمكن ضبطها سواء الأصداء إلى هذا الحد الأقصى.
مشكلة واحدة محتملة للنهج مشاركة DR - السيارات أيضا أن تتم مناقشة أي إشارة DR - السيارات سوف يعتمد على توزيع متجانس للجزيء رامان النشطة تضخيم. لكائنات معظم البيولوجية ، وهذا يمكن أن يكون جيدا OH صدى واسع من المياه ، وهي وفيرة ومنتشرة في كل مكان تقريبا. هو والمياه ومع ذلك ، يستبعد من المناطق مسعور مع خلية ، مثل قطرات الدهون ، مما يؤدي إلى تشويه الإشارات التي تم الحصول عليها باستخدام الرنين عندما المياه لتضخيم وسائط الدهون. في مثالنا ، وقد استخدمنا محلول الجلوكوز deuterated لتوليد إشارة يمكن كشفها بسهولة وفيرة لدينا عينة بيولوجية. وبالمثل ، deuterated الماء أو deuterated buffe البيولوجيةويمكن استخدام التمرير ، مثل د HEPES. في مثالنا ، والدهون داخل قطرات C. وايليجانس دودة صغيرة بما يكفي لاحتواء كل الأحوال ، فإن الحل deuterated الجلوكوز والدهون في بقعة الليزر المركزة لنظامنا. هذا ، ومع ذلك ، لا ينطبق عموما. ومن الأمثلة سيما أن الخلايا الشحمية ، التي تولد قطرات الدهون بدلا كبيرة داخل السيتوبلازم بهم. وهذا يعني ، أي التجربة التي أجريت مع تقنية DR - السيارات يتطلب إعدادا دقيقا ومراقبة التجارب للتحقق من النتائج.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر إيوان Schie وسيباستيان Wachsmann - Hogiu لما قدموه من مساهمات في تطوير تقنية DR - السيارات. تايلر أسبوعين يقر الدعم المقدم من برنامج الباحث لورنس من مختبر لورانس ليفرمور. توماس Huser تشعر بالامتنان للدعم من رابطة القلب الأميركية من خلال برنامج المنح في والمعونة. كما أيد هذا العمل في جزء من التمويل من مؤسسة العلوم الوطنية. ويدير مركز بيوفوتونيك ، وجبهة الخلاص الوطني ومركز علوم التكنولوجيا ، من جامعة كاليفورنيا في ديفيز ، في إطار الاتفاق التعاوني رقم 0120999 PHY. ومن المسلم به أيضا دعما من مركز العلوم السريرية UCD بالحركة تحت رقم UL1 RR024146 منحة من المركز الوطني لبحوث الموارد (NCRR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60X water immersion objective | Olympus Corporation | UPLSAPO 60XW | |
| Inverted Microscope | Olympus Corporation | IX-71SIF-3 | |
| Pockels Cell | ConOptics | 350-160 | |
| Picotrain pump Laser | HighQ | IC-1064-10000 | |
| Optical Parametric Oscillator | APE | Levante IR | |
| 1.5 Glass cover slips | Fisher Scientific | 12-545-102 25cm-1 | |
| Half-wave plates | Thorlabs Inc. | AHWP05M-980 | |
| Polarizing Beam Splitter Cubes | Thorlabs Inc. | PBS052 or PBS053 | |
| Spectrometer/Monochromator | Princeton Instruments/Acton | Spectra Pro 2300i | |
| CCD Camera | Princeton Instruments/Acton | PIXIS: 100B | |
| Avalanche Photo Diode | PerkinElmer, Inc. | SPCM-AGR-14-12691 | |
| XYZ Piezo Stage | Physik Instruments | P 733-2CL P 721.CDQ | This is a combination of an XY stage and a Z objective holder |
| Dichroic Mirrors | Semrock | Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25 | These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient. |
| Dichroic Mirror | Chroma Technology Corp. | Z830rdc | To combine the different near-infrared laser beams |
| TCSPC board | PicoQuant | Timeharp 200 | |
| Symphotime Imaging Software | PicoQuant | ||
| Matlab | Mathworks |
References
- Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. J Opt Soc Am B. 19 (9), (2002).
- Tolles, W. M., Nibler, J. W., McDonald, J. R., Harvey, A. B. A Review of the Theory and Application of Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS). Appl Spectrosc. , (1977).
- Weeks, T., Schie, I. W., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. Signal generation and Raman-resonant imaging by non-degenerate four-wave mixing under tight focusing conditions. J Biophoton. 3 (3), 169-175 (2010).
- Weeks, T., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. Raman Microscopy based on Doubly-Resonant Four-Wave Mixing (DR-FWM). Opt Express. 17 (19), 17044-17051 (2009).
- Schie, I. W., Weeks, T., McNerney, G. P., Fore, S., Sampson, J. K., Wachsmann-Hogiu, S., Rutledge, J. C., Huser, T. Simultaneous forward and epi-CARS microscopy with a single detector by time-correlated single photon counting. Optics Express. 16 (3), 2168-2175 (2008).
