结合三个单一波长的短脉冲激光器是用来产生相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)和双谐振车(DR车)。这些信号之间的区别,否则很难察觉连贯的拉曼信号增强的灵敏度,使弱拉曼散射成像。
相干拉曼成像技术已经看到在过去的十年活动急剧增加,因为他们的承诺,使无标记的光学成像与分子特异性高 1 。然而,这些技术的灵敏度,幅度比荧光较弱的许多订单,要求毫摩尔1,2分子浓度。在这里,我们描述了一个从强或丰富的拉曼散射获得其信号放大技术,可以使弱拉曼活性分子或低浓度的检测。短脉冲激光在生物样品的相互作用产生的各种连贯的拉曼散射信号,每个对样品进行了独特的化学信息。通常情况下,这些信号,如相干反斯托克斯拉曼散射(CARS),只有一个用于生成图像,而其他的被丢弃。然而,当这些信号,包括汽车三色和四波混频(FWM),收集和比较,汽车信号,否则就很难检测到的信息可以被提取3。例如,双共振车(DR车)是建设性的两个共振信号干扰的结果。我们将演示如何2845厘米-1 CH脂质的伸缩振动和2120厘米-1的CD伸展的一个氘分子(如氘代糖,脂肪酸等)的振动产生的DR -汽车信号所需的三个激光微调可以用来同时探头都拉曼共振。在这些条件下,除了汽车从每个共振,合并DR车信号探测无论是也产生信号。我们演示了如何检测的DR车的信号,并从丰富的分子的振动放大信号,可用于增强信号较弱的敏感性之间的差异。我们进一步证明,这种做法甚至延伸到应用两个信号产生不同的分子,例如,使用强溶剂的拉曼信号,这样可以提高稀溶质的拉曼信号弱。
拉曼光谱和拉曼成像是在生物科学领域的强大的新兴工具。目前,这是在体内和体外细胞代谢和在加工和贮存的脂质代谢紊乱的研究尤其如此。大部分生物大分子中含有大量的类似,主要是碳基分子键,使拉曼光谱,从细胞和有机体获得通常是由脂类,蛋白质,核酸,糖类的贡献卷积,等血脂相对容易隔离从这些复杂的光谱,因为他们的倾向,形成密集的水滴或双层,因为它们含有大量的脂肪CH键的扩展链。然而,我们有能力隔离的复杂的细胞环境内特定的蛋白质,氨基酸,核糖核酸或DNA非常有限。如果感兴趣的这些分子是目前唯一在μM浓度及以下,尤其是这样。在这里,探测能力弱拉曼共振,利用我们新推出的DR -车不同的成像技术提供了一个潜在的强大的方法,其化学微量分析和成像。诚然,在本议定书中最复杂的部分是激光系统的路线和同步。当从头开始,同步脉冲,即确保脉冲在时间上是重叠的,尽管他们采取不同的路径可以通过使用脉冲自相关便利。一旦空间和时间上的重叠是实现,汽车和DR -汽车信号应易被察觉。然而,第一次对准往往是原油,造成弱信号。调整这个系统的最佳做法是,最初产生的微弱信号,并然后轻轻调整沿每条路径的反射镜和调整使用的延迟阶段的时间重叠,以改善信号强度。虽然光谱仪/单色行为,作为一个非常有效的挡板,室内光线干净的结果可以实现经营与室内灯光系统关闭,窗帘或镜头油管,以尽量减少其他各种光源(如电脑显示器推出的背景,指示灯,指示灯等)。
我们特别设置利用单光子计数雪崩光电二极管(APD)探测器和时间相关单光子计数(TCSPC)硬件检测5。这使我们能够极其微弱信号检测与相对低噪音,但许多团体与可变增益优势进行类似的测量时,发现了光电倍增管(PMT)。光电倍增管的优势是,他们提供的可变增益,有一个更大的探测区域,可以简化探测器的对齐方式。此外,我们的设置利用压电阶段转化的目标,为了实现光束扫描。这样做的好处是,我们有能力返回到以前扫描的图像具有较高的精确度内的任何部位,并采取额外的测量,包括自发的拉曼光谱。其他研究小组已经成功地利用扫描镜组件,甚至整个共焦扫描单元,如奥林巴斯FluoView系统,它提供了更快的成像能力,但它能够精确地在图像中任意位置的限制。
调谐激光器相匹配的拉曼共振也是一个重要的步骤,可能需要一些优化。虽然可称为拉曼峰从DR汽车和汽车获得最大的谱峰强度并不一定对应自发拉曼峰的最大值。这是由于内在的四波混合导致非共振背景信号和汽车,歪曲车光谱相对自发的拉曼光谱产生的信号干扰。光谱的位置,可以计算的汽车信号的峰值,但一个更实际的做法是调整几个小跨预期的位置拉曼共振光谱步骤OPOS的。这个过程应该产生一个明确的最高。事实上,从DR – FWM最敏感的共振都必须进行调整这个最大值。
的DR车的方法的最后一个潜在的问题也可以讨论,即DR的车信号,将取决于一个均匀分布的拉曼放大积极分子。对于大多数的生物对象,这很可能是广泛的OH共振,从水,这是丰富,几乎无所不在。水,然而,排除疏水区域,一个单元格,利用水的共振放大脂质模式时,得到的信号失真,如脂滴的领先。在我们的例子中,我们已经使用了一个氘葡萄糖溶液,产生不易察觉和丰富我们的生物样品的信号。同样,氘的水或氘生物buffeRS,如D – HEPES,都可以使用。在我们的例子中,脂滴内的C.线虫蠕虫足够小,总是包含在我们的系统聚焦激光光斑的氘的葡萄糖溶液和脂质。然而,这不是一般的真实。一个特殊的例子,将脂肪细胞,细胞质内产生相当大的脂滴。这意味着,与DR汽车技术进行任何实验,需要精心的准备和控制的实验来验证的结果。
The authors have nothing to disclose.
我们想感谢他们的贡献,在发展的DR汽车技术伊万Schie和塞巴斯蒂安Wachsmann Hogiu。泰勒周承认从劳伦斯 – 利弗莫尔国家实验室的劳伦斯学者奖励计划“的支持。托马斯Huser是通过赠款援助计划的美国心脏协会的支持表示感谢。部分由美国国家科学基金会的资助下,这项工作也得到了支持。生物光子学中心,美国国家科学基金会科学技术中心,是由加利福尼亚大学戴维斯分校管理,根据合作协议的PHY 0120999号。也承认,从授予数量UL1 RR024146下的UCD临床转化科学中心从国家研究资源(NCRR)中心的支持。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
60X water immersion objective | Olympus | UPLSAPO 60XW | ||
Inverted Microscope | Olympus | IX-71SIF-3 | ||
Pockels Cell | ConOptics | 350-160 | ||
Picotrain pump Laser | HighQ | IC-1064-10000 | ||
Optical Parametric Oscillator | APE | Levante IR | ||
1.5 Glass cover slips | Fisher Scientific | 12-545-102 25cm-1 | ||
Half-wave plates | Thor Labs | AHWP05M-980 | ||
Polarizing Beam Splitter Cubes | Thor Labs | PBS052 or PBS053 | ||
Spectrometer/Monochromator | PI Acton | Spectra Pro 2300i | ||
CCD Camera | PI Acton | PIXIS: 100B | ||
Avalanche Photo Diode | Perkin Elmer | SPCM-AGR-14-12691 | ||
XYZ Piezo Stage | Physik Instruments | P 733-2CL P 721.CDQ |
This is a combination of an XY stage and a Z objective holder | |
Dichroic Mirrors | Semrock | Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25 |
These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient. | |
Dichroic Mirror | Chroma | Z830rdc | To combine the different near-infrared laser beams | |
TCSPC board | PicoQuant | Timeharp 200 | ||
Symphotime Imaging Software | PicoQuant | |||
Matlab | Mathworks |