En kombination av tre enda våglängd kort pulsad laser används för att generera konsekvent anti-Stokes Ramanspridning (CARS) och dubbelt-resonanta bilar (DR-bilar). Skillnaden mellan dessa signaler ger bättre känslighet för annars är svårt att upptäcka sammanhängande Raman signaler, vilket möjliggör avbildning av svag Raman spridare.
Sammanhängande Raman avbildningstekniker har sett en dramatisk ökning av aktiviteten under det senaste decenniet på grund av sitt löfte att göra det möjligt etiketten utan optisk avbildning med hög molekylär specificitet 1. Känslighet för dessa tekniker är dock många storleksordningar svagare än fluorescens, vilket kräver milli-molar molekylära koncentrationer 1,2. Här beskriver vi en teknik som kan möjliggöra upptäckt av svaga eller låga koncentrationer av Raman-aktiva molekyler genom att förstärka sin signal med uppgifter från starka eller riklig Raman spridare. Samspelet mellan korta pulsad laser i ett biologiskt prov genererar en mängd sammanhängande Ramanspridning signaler, som alla bär unika kemiska information om provet. Normalt är bara en av dessa signaler, t ex Coherent Anti-Stokes Ramanspridning (CARS), används för att skapa en bild medan de andra tas bort. Men när dessa andra signaler, inklusive 3-färg Personvagnar och fyra-våg blandning (FWM), samlas in och jämförs med CARS signalen, kan annars är svårt att identifiera information hämtas 3. Till exempel är dubbelt-resonant bilar (DR-CARS) resultatet av konstruktiv interferens mellan två resonant signaler 4. Vi visar hur inställning av tre lasrar krävs för att producera DR-bilar signaler till 2845 cm -1 CH sträcka vibrationer i lipider och 2120 cm -1 CD stretching vibrationen av en deuterated molekyl (t.ex. deuterated sockerarter, fettsyror, etc.) kan utnyttjas för att undersöka både Raman resonanser samtidigt. Under dessa förhållanden, förutom CARS signaler från varje resonans, en kombinerad DR-CARS signalen sondering båda också genereras. Vi visar hur upptäcka skillnaden mellan DR-CARS signalen och förstärker signalen från en riklig molekylens vibrationer kan användas för att öka känsligheten för den svagare signalen. Vi visar vidare att detta tillvägagångssätt även sträcker sig till applikationer där båda signalerna genereras från olika molekyler, så att t.ex. med hjälp av den starka Raman signal om ett lösningsmedel kan förbättra den svaga Raman signal om en utspädd lösning.
Raman-spektroskopi och Raman-baserad avbildning är kraftfulla nya verktyg i bio vetenskaper. För närvarande gäller detta särskilt för in vivo och in vitro studier av cellulär metabolism och metabola sjukdomar i bearbetning och lagring av lipider. De flesta biologiska makromolekyler innehåller ett stort antal liknande, de flesta kolbaserade molekylbindningar, så att Raman spektra från celler och organismer är vanligtvis en faltning av bidrag från lipider, proteiner, nukleinsyror, socker, etc. Lipider är relativt lätt att isolera från dessa komplexa spektra, på grund av deras tendens att bilda täta droppar eller bilayers och eftersom de innehåller längre kedjor med ett stort antal obligationer alifatiska CH. Vår förmåga att isolera specifika proteiner, aminosyror, RNA eller DNA i den komplexa cellulära miljön är dock mycket begränsad. Detta gäller särskilt om dessa molekyler av intresse är bara närvarande vid mikroM koncentrationer och nedan. Här ger möjlighet att söka svaga Raman resonanser utnyttja vår nyligen introducerade DR-bilar tekniken skillnad avbildning ett potentiellt kraftfullt strategi för deras kemiska mikroanalys och bildhantering. Visserligen är den mest komplicerade delen av detta protokoll för anpassning och synkronisering av lasersystem. När man börjar från scratch, synkronisering av pulser, se dvs att pulserna överlappas i tiden trots olika vägar de tar kan underlättas genom användning av en puls autocorrelator. När rumsliga och tidsmässiga överlappning uppnås, bilar och DR-bilar signaler bör vara lätt upptäckas. Dock är den första justeringen ofta råa, vilket resulterar i svaga signaler. Det bästa praxis för att rikta det här systemet är väl att inledningsvis skapa svaga signaler och sedan för att förbättra signalstyrkan genom att försiktigt tweaking speglarna längs varje väg och justera tidsmässiga överlappningen med förseningen steg. Även spektrometern / monokromator fungerar som en mycket effektiv baffel för rumsbelysning det renaste resultat kan uppnås genom att tillämpa systemet med rummets belysning avstängd och gardiner eller objektivet rör för att minimera bakgrunden införts av flera andra ljuskällor (t.ex. datorskärmar, tänds, lysdioder osv.)
Vår specifika konfiguration använder single-photon räknar lavin fotodioden (APD) detektorer och tidskorrelerade enda foton räkna (TCSPC) hårdvara för att upptäcka 5. Detta ger oss möjlighet att upptäcka extremt svaga signaler med relativt låg ljudnivå, men många grupper har hittat foto-multiplikator rör (PMT: s) med variabel förstärkning fördel när man gör liknande mätningar. Fördelen med PMT: s är att de erbjuder varierande vinna och har en mycket större upptäckt område som kan förenkla anpassningen av detektorn. Dessutom använder vår inställning piezo steg att översätta de mål för att uppnå balk skanning. Fördelen med detta är att vi har förmågan att gå tillbaka till någon plats inom det tidigare skannad bild med en hög grad av noggrannhet och ta ytterligare mätningar inklusive spontana Raman spektra. Andra grupper har lyckats utnyttja skanning spegel församlingar, eller hela konfokal enheter skanning som Olympus FluoView systemet, som ger mycket snabbare bildhantering, men är begränsad i sin förmåga att exakt återvända till godtyckliga platser i en bild.
Tuning lasrarna att matcha Raman resonans är också ett viktigt steg som kan kräva en del optimering. Även om Raman topparna kan vara känt den maximala spektraltopp intensiteten från DR-bilar och bilar inte nödvändigtvis motsvarar den högsta av de spontana Raman topp. Detta beror på den inneboende störningar av signaler som genereras av fyra våg blandning leder till en icke-resonant bakgrund signal och bilar, som snedvrider CARS spektra förhållande till spontana Raman spektra. Den spektrala läge toppen av CARS signalen kan beräknas, men en mer praktisk metod är att ställa in OPOS i flera, små spektrala steg över den förväntade platsen för Raman resonans. Denna process bör ge ett tydligt maximum. I själva verket, för den största känsligheten från DR-FWM båda resonanser måste vara inställda på detta tak.
En sista potentiellt problem i DR-bilar tillvägagångssätt har också diskuteras, dvs DR-CARS signalen beror på en homogen fördelning av Raman-aktiva förstärka molekyl. För de flesta biologiska objekt, kan detta vara väl breda OH resonans från vatten, som är riklig och nästan allestädes närvarande. Vatten är dock undantagna från hydrofoba regioner med en cell, till exempel lipid droppar, vilket leder till en snedvridning av de signaler som erhålls när använder vattnet resonans för att förstärka lipid lägen. I vårt exempel har vi använt en lösning av deuterated glukos för att skapa en enkelt kan upptäckas och riklig signal för vår biologiska prov. Likaså deuterated vatten eller deuterated biologiska Buffers, såsom d-HEPES kunde användas. I vårt exempel lipiddropparna inom C. elegans mask var små nog att alltid innehålla både det deuterated glukoslösning och lipider inom fokuserad laser plats i vårt system. Detta är dock i allmänhet inte sant. Ett särskilt exempel skulle vara adipocyter, som genererar ganska stora lipiddropparna inom sina cytoplasman. Detta innebär kräver varje experiment som utfördes med DR-CARS teknik noggranna förberedelser och experiment kontroll för att verifiera resultaten.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Iwan Schie och Sebastian Wachsmann-Hogiu för deras bidrag i utvecklingen av DR-bilar teknik. Tyler veckor erkänner stöd av Lawrence Scholar Program från Lawrence Livermore National Laboratory. Thomas Huser är tacksam för stöd från American Heart Association genom beviljandet-i-stödprogram. Detta arbete stöddes också delvis av medel från National Science Foundation. Centrum för biofotonik, en NSF vetenskapligt och tekniskt centrum, leds av University of California, Davis, enligt samarbetsavtal Nej PHY 0.120.999. Stöd ges även bekräftas från UCD Clinical Translationell Science Center i licensnummer UL1 RR024146 från National Center for Research Resources (NCRR).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
60X water immersion objective | Olympus | UPLSAPO 60XW | ||
Inverted Microscope | Olympus | IX-71SIF-3 | ||
Pockels Cell | ConOptics | 350-160 | ||
Picotrain pump Laser | HighQ | IC-1064-10000 | ||
Optical Parametric Oscillator | APE | Levante IR | ||
1.5 Glass cover slips | Fisher Scientific | 12-545-102 25cm-1 | ||
Half-wave plates | Thor Labs | AHWP05M-980 | ||
Polarizing Beam Splitter Cubes | Thor Labs | PBS052 or PBS053 | ||
Spectrometer/Monochromator | PI Acton | Spectra Pro 2300i | ||
CCD Camera | PI Acton | PIXIS: 100B | ||
Avalanche Photo Diode | Perkin Elmer | SPCM-AGR-14-12691 | ||
XYZ Piezo Stage | Physik Instruments | P 733-2CL P 721.CDQ |
This is a combination of an XY stage and a Z objective holder | |
Dichroic Mirrors | Semrock | Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25 |
These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient. | |
Dichroic Mirror | Chroma | Z830rdc | To combine the different near-infrared laser beams | |
TCSPC board | PicoQuant | Timeharp 200 | ||
Symphotime Imaging Software | PicoQuant | |||
Matlab | Mathworks |