Een combinatie van drie enkele golflengte korte gepulste lasers wordt gebruikt om coherent anti-Stokes Raman scattering (auto's) en dubbel-resonante CARS (DR-CARS) te genereren. Het verschil tussen deze signalen zorgt voor een verbeterde gevoeligheid voor anders moeilijk te coherent Raman signalen te detecteren, waardoor beeldvorming van zwakke Raman scatterers.
Coherente Raman beeldvormende technieken hebben gezien een dramatische toename van de activiteit de afgelopen tien jaar als gevolg van hun belofte om label-free optische beeldvorming mogelijk is met een hoog moleculair specificiteit 1. De gevoeligheid van deze technieken is echter vele ordes van grootte zwakker dan fluorescentie, die milli-molaire moleculaire concentraties 1,2. Hier beschrijven we een techniek die de detectie van zwakke of lage concentraties van de Raman-actieve moleculen kunnen inschakelen door hun signaal versterken met die verkregen uit sterk of overvloedige Raman scatterers. De interactie van korte gepulste lasers in een biologisch monster genereert een scala aan samenhangende Raman scattering signalen, elk van die zich bezighouden met unieke chemische informatie over het monster. Typisch, is slechts een van deze signalen, bijv. Coherent Anti-Stokes Raman scattering (CARS), gebruikt om een beeld te genereren, terwijl de anderen worden verwijderd. Echter, wanneer deze andere signalen, waaronder drie-kleuren CARS en vier-wave mixing (FWM), worden verzameld en vergeleken met de CARS-signaal, kan anders moeilijk om informatie te sporen worden geëxtraheerd 3. Bijvoorbeeld, dubbel-resonante CARS (DR-CARS) is het resultaat van de constructieve interferentie tussen twee resonantie signalen 4. We zien hoe afstemming van de drie lasers nodig zijn om DR-CARS-signalen te produceren om de 2845 cm -1 CH strekvibratie in lipiden en de 2120 cm -1 CD rekken trilling van een gedeutereerde molecuul (bijvoorbeeld gedeutereerde suikers, vetzuren, enz.) kan worden gebruikt om tegelijkertijd probe beide Raman resonanties. Onder deze omstandigheden, in aanvulling op CARS signalen van iedere resonantie, een gecombineerde DR-CARS signaal probing beiden is ook gegenereerd. We zien hoe het detecteren van het verschil tussen de DR-CARS-signaal en het versterken van het signaal van trillingen een overvloedige molecuul kan worden gebruikt om de gevoeligheid voor de zwakkere signaal te verbeteren. We verder laten zien dat deze aanpak ook geldt voor toepassingen waar de beide signalen worden gegenereerd uit verschillende moleculen, zoals dat bijvoorbeeld het gebruik van de sterke Raman signaal van een oplosmiddel kan de zwakke Raman-signaal van een verdunde opgeloste stof te verbeteren.
Raman spectroscopie en Raman-based imaging zijn krachtige nieuwe tools in de bio-wetenschappen. Op dit moment, dit geldt met name voor de in vivo en in vitro onderzoek van cellulaire metabolisme en metabole stoornissen in de verwerking en opslag van lipiden. De meeste bio-macromoleculen bevatten een groot aantal vergelijkbare, meestal op koolstof gebaseerde moleculaire bindingen, zodat de Raman-spectra verkregen uit cellen en organismen meestal een convolutie van de bijdragen van lipiden, eiwitten, nucleïnezuren, suikers, etc. Lipiden zijn relatief eenvoudig te isoleren van deze complexe spectra, vanwege hun neiging om dichte druppels of dubbellagen vorm en omdat ze bevatten uitgebreid ketens met een groot aantal alifatische CH bindingen. Ons vermogen om specifieke eiwitten, aminozuren, RNA of DNA te isoleren binnen de complexe cellulaire omgeving is echter zeer beperkt. Dit geldt met name als deze moleculen van belang zijn alleen aanwezig in uM concentraties en hieronder. Hier is de mogelijkheid om zwakke Raman resonanties gebruik te maken van onze nieuw geïntroduceerde DR-CARS verschil beeldvormende techniek sonde biedt een potentieel krachtige aanpak voor hun chemische microanalyse en beeldvorming. Toegegeven, de meest ingewikkelde deel van dit protocol is de afstemming en synchronisatie van het lasersysteem. Bij het starten vanaf nul, de synchronisatie van de pulsen, dat wil zeggen ervoor te zorgen dat de pulsen overlappen in de tijd, ondanks de verschillende wegen die zij nemen kan worden vergemakkelijkt door het gebruik van een puls autocorrelator. Zodra ruimtelijke en temporele overlap wordt bereikt, auto's en DR-CARS-signalen moet gemakkelijk detecteerbaar. Echter, de eerste uitlijning is vaak ruw, wat resulteert in zwakke signalen. De best practice voor het uitlijnen van dit systeem goed is om in eerste instantie het genereren van zwakke signalen en vervolgens aan de signaalsterkte te verbeteren door voorzichtig tweaken de spiegels langs elke weg en het aanpassen van de temporele overlap met behulp van de vertraging fasen. Hoewel de spectrometer / monochromator fungeert als een zeer efficiënte klankbord voor de kamer het licht van de schoonste resultaten kunnen worden bereikt door gebruik van het systeem met verlichting in de kamer uitgeschakeld en gordijnen of lens buis op de achtergrond die door de verschillende andere lichtbronnen (bijv. computer beeldschermen te minimaliseren, indicator licht, LED's, etc.).
Onze specifieke setup maakt gebruik van single-photon tellen lawine foto-diode (APD) detectoren en time-gecorreleerd single photon tellen (TCSPC) hardware voor detectie 5. Dit stelt ons in staat om uiterst zwakke signalen te detecteren met een relatief laag geluidsniveau, maar veel groepen hebben gevonden photo-multiplier buizen (PMT's) met een variabele gain voordeel bij het maken van vergelijkbare metingen. Het voordeel van de PMT's is dat ze een variabele gain bieden en hebben een veel groter detectiebereik die uitlijning van de detector kan vereenvoudigen. Bovendien, onze setup maakt gebruik van piëzo-etappes aan de doelstelling te vertalen om scanning te bereiken. Het voordeel hiervan is dat we de mogelijkheid om op een plek terug te keren binnen de eerder gescande beeld met een hoge graad van nauwkeurigheid en aanvullende metingen met inbegrip van spontane Raman-spectra hebben. Andere groepen waren succesvol gebruik te maken van scanning spiegel vergaderingen, of zelfs hele confocale scanning-eenheden zoals de Olympus FluoView systeem, dat veel sneller beeldvorming biedt, maar is beperkt in zijn vermogen om nauwkeurig naar willekeurige locaties terug te keren binnen een afbeelding.
Afstemmen van de lasers overeenkomen met de resonantie Raman is ook een kritische stap die sommige optimalisatie nodig heeft. Hoewel de Raman pieken kunnen worden gekend de maximale spectrale piek intensiteit verkregen van DR-auto's en auto niet noodzakelijk overeen met het maximum van de spontane Raman piek. Dit is te wijten aan de intrinsieke interferentie van signalen gegenereerd door vier-wave mixing leidt tot een niet-resonante achtergrond signaal en auto's, welke auto's spectra ten opzichte van spontane Raman-spectra vervormt. De spectrale plaats van de piek van de CARS-signaal kan worden berekend, maar een meer praktische aanpak is om het OPO af te stemmen op verschillende, kleine spectrale stappen over de verwachte locatie van de Raman resonantie. Dit proces moet opleveren een duidelijk maximum. In feite, voor de grootste gevoeligheid van de DR-FWM beide resonanties moet worden afgestemd op dit maximum.
Een laatste potentieel probleem van de DR-CARS aanpak moet ook worden besproken, dat wil zeggen de DR-CARS-signaal is afhankelijk van een homogene verdeling van de Raman-actieve versterken molecuul. Voor de meeste biologische objecten, zou dit wel eens de brede OH resonantie van water, dat is overvloedig en bijna alomtegenwoordig. Water is echter uitgesloten van hydrofobe regio's met een cel, zoals lipide druppels, waardoor een verstoring van de signalen verkregen wanneer gebruik te maken van het water resonantie aan lipide modi versterken. In ons voorbeeld hebben we gebruik gemaakt van een oplossing van gedeutereerde glucose naar een gemakkelijk te detecteren en overvloedige signaal voor onze biologisch monster te genereren. Ook gedeutereerde water of gedeutereerde biologische Buffers, zoals d-HEPES kunnen worden gebruikt. In ons voorbeeld, de lipide druppels in de C. elegans worm waren klein genoeg om zowel de gedeutereerde glucose-oplossing en lipiden bevatten altijd binnen de laser-plek van ons systeem. Dit is echter niet altijd waar. Een bijzonder voorbeeld hiervan is adipocyten, wat vrij groot lipide druppels te genereren in hun cytoplasma. Dit betekent een experiment uitgevoerd met de DR-CARS-techniek vereist een zorgvuldige voorbereiding en controle-experimenten om de resultaten te verifiëren.
The authors have nothing to disclose.
We willen graag Iwan Schie en Sebastian Wachsmann-Hogiu bedanken voor hun bijdragen in de ontwikkeling van de DR-CARS-techniek. Tyler Weken erkent steun van de Lawrence Scholar Program van Lawrence Livermore National Laboratory. Thomas Huser is dankbaar voor de steun van de American Heart Association door de Grant-in-Aid programma. Dit werk werd ook ondersteund voor een deel door de financiering van de National Science Foundation. Het Centrum voor Biofotonica, een NSF Wetenschap en Technologie Centrum, wordt beheerd door de Universiteit van California, Davis, onder Cooperative arbeidsovereenkomst nr. PHY 0120999. Support is tevens erkend door de UCD Clinical Translationeel Science Center onder te verlenen nummer UL1 RR024146 van het National Center for Research Resources (NCRR).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
60X water immersion objective | Olympus | UPLSAPO 60XW | ||
Inverted Microscope | Olympus | IX-71SIF-3 | ||
Pockels Cell | ConOptics | 350-160 | ||
Picotrain pump Laser | HighQ | IC-1064-10000 | ||
Optical Parametric Oscillator | APE | Levante IR | ||
1.5 Glass cover slips | Fisher Scientific | 12-545-102 25cm-1 | ||
Half-wave plates | Thor Labs | AHWP05M-980 | ||
Polarizing Beam Splitter Cubes | Thor Labs | PBS052 or PBS053 | ||
Spectrometer/Monochromator | PI Acton | Spectra Pro 2300i | ||
CCD Camera | PI Acton | PIXIS: 100B | ||
Avalanche Photo Diode | Perkin Elmer | SPCM-AGR-14-12691 | ||
XYZ Piezo Stage | Physik Instruments | P 733-2CL P 721.CDQ |
This is a combination of an XY stage and a Z objective holder | |
Dichroic Mirrors | Semrock | Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25 |
These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient. | |
Dichroic Mirror | Chroma | Z830rdc | To combine the different near-infrared laser beams | |
TCSPC board | PicoQuant | Timeharp 200 | ||
Symphotime Imaging Software | PicoQuant | |||
Matlab | Mathworks |