Imaging differenziale delle strutture biologiche con Doppiamente-risonanza coerente Anti-Stokes scattering Raman (CARS)

Summary

Una combinazione di tre singola lunghezza d'onda a breve impulsi laser viene utilizzato per generare coerente anti-Stokes scattering Raman (CARS) e doppiamente AUTO-risonante (DR-CARS). La differenza tra questi segnali fornisce maggiore sensibilità perché altrimenti difficili da individuare coerenti segnali Raman, che consente l'imaging di debole dispersori Raman.

Abstract

Coerente tecniche di imaging Raman hanno visto un drammatico aumento delle attività nell'ultimo decennio a causa della loro promessa di permettere l'etichetta senza l'imaging ottico ad alta specificità molecolare ^1. La sensibilità di queste tecniche, tuttavia, è molti ordini di grandezza più debole di fluorescenza, che richiedono milli-molare ^1,2 molecolare concentrazioni. Qui, descriviamo una tecnica che può consentire di rilevare basse concentrazioni di debole o di Raman-attivo molecole, amplificando il loro segnale con quello ottenuto da dispersori Raman forti o abbondanti. L'interazione di brevi impulsi laser in un campione biologico genera una varietà di segnali coerenti scattering Raman, ognuno dei quali portano informazioni uniche sulla chimica del campione. In genere, solo uno di questi segnali, ad esempio coerente di lotta alla stokes scattering Raman (CARS), viene usato per generare un'immagine mentre gli altri vengono eliminati. Tuttavia, quando questi altri segnali, di cui 3 colori CARS e quattro-wave mixing (FWM), sono raccolti e confrontati con il segnale di CARS, altrimenti difficili da rilevare informazioni possono essere estratte ^3. Per esempio, AUTO doppiamente risonante (DR-AUTO) è il risultato di interferenza costruttiva tra i due segnali di risonanza ^4. Noi dimostrare come messa a punto dei tre laser necessaria per produrre DR-CARS segnali al centimetro 2845 ^-1 vibrazioni tratto CH in lipidi e il CM 2120 ^-1 vibrazioni CD allungamento di una molecola deuterato (ad esempio zuccheri deuterati, acidi grassi, ecc) può essere utilizzato per sondare sia risonanze Raman contemporaneamente. In queste condizioni, in aggiunta ai segnali CARS da ogni risonanza, un combinato DR-AUTO segnale sondaggio sia anche generato. Dimostriamo come rilevare la differenza tra il modello DR-CARS segnale e il segnale da amplificare le vibrazioni di una molecola abbondante può essere utilizzato per migliorare la sensibilità per il segnale più debole. Abbiamo inoltre dimostrato che questo approccio si estende anche ad applicazioni dove si generano i due segnali di molecole diverse, in modo che ad esempio utilizzando il forte segnale Raman di un solvente può migliorare il segnale debole Raman di un soluto diluito.

Protocol

1. Generazione di auto e DR-CARS Segnali

Al fine di generare CARS e DR-CARS segnali contemporaneamente, tre fonti breve sintonizzabile e sincronizzata laser pulsati sono obbligatori.

1. Per ottenere tre impulsi sincronizzati si inizia con un singolo 10 W laser (PicoTrain, HighQ laser, Inc.). Questo laser ha una lunghezza d'onda fissa di 1064 nm, una lunghezza di impulso fisso di 7 ps, e un tasso di ripetizione fissa di 76 MHz.
2. Utilizzando una serie di semionda lastre e cubetti di polarizzazione divisore di fascio il fascio viene diviso in tre parti. Un semionda piatto abbinato ad un cubo beam splitter polarizzante ci permette di regolare la quantità di energia in ogni componente del fascio senza cambiare la sua direzione. Tipicamente, due fasci sono adeguati per ~ 4,5 W ciascuno, e il terzo fascio contiene il restante 1 W.
3. I due fasci ad alta potenza sono poi diretti in due oscillatori indipendenti parametrici ottici (OPO, la Avante, APE GmbH, Berlino, Germania). OPO uso di generazione di frequenza differenza di convertire un fotone di energia superiore in due fotoni di energia inferiore con diverse lunghezze d'onda. Controllando la temperatura del cristallo utilizzato per ottenere questo effetto, le lunghezze d'onda dei fotoni risultante può essere controllato di 0,1 nm. Per frequenza raddoppio questi segnali, un laser con lunghezza d'onda fissa di 1064 nm può essere trasformato in un raggio laser che può essere sintonizzato ovunque tra 780 nm a 910 nm. Pompando due distinti OPO con la stessa fonte di 1064 nm, si ottengono due sorgenti laser sintonizzabile in modo indipendente che vengono automaticamente sincronizzati con i nostri laser della pompa originale.
4. La terza (potenza più bassa) dal fascio laser 1064 nm pompa è diretto in tutto il OPO è da una combinazione di specchi dicroici in modo che tutti e tre i fasci (2 da OPOS, 1 dal laser di pompa) possono essere ricombinati in seguito. Al fine di produrre in modo efficiente coerente fotoni segnale Raman gli impulsi ricombinati devono essere sovrapposti sia temporalmente e spazialmente. OPO perché contengono cavità anello, permettendo ad ogni impulso laser di passare attraverso il cristallo più volte, le travi inviati attraverso i viaggi del OPO è una distanza in più con conseguente notevole ritardo rispetto al fascio di pompa originale. Questa distanza deve essere compensata con il terzo fascio con l'introduzione di specchi in più che forza questo raggio per percorrere la stessa distanza come gli altri due prima di essere ricombinati con specchi dicroici.
5. Al fine di fornire la regolazione fine della lunghezza del percorso di ciascun fascio viaggia fasi ritardo regolabile, utilizzando retroriflettori prisma, vengono introdotti in ogni percorso del raggio.
6. Un'altra serie di semionda lastre e cubetti di polarizzazione del fascio splitter vengono aggiunti a ogni raggio per permetterci di regolare la potenza di ogni fascio in modo indipendente senza influenzare l'ingresso del OPO è.
7. Specchi dicroici sono utilizzate per combinare la prima delle due travi OPO e poi con il fascio di 1064 nm. Si deve prestare attenzione per assicurare che le travi sono esattamente sovrapposti (cioè sono allineati e hanno divergenza simili). Questo può essere verificato confrontando la sovrapposizione delle travi vicino a (pochi centimetri) e lontano da (~ 1 m) lo specchio dicroico.
8. Il vantaggio di utilizzare laser pulsati è che ogni impulso può avere un alta energia di picco al campione, consentendo per la generazione efficiente di segnali Raman coerente, pur mantenendo una bassa intensità media. Una intensità media alta può danneggiare il campione. Pertanto al fine di controllare ulteriormente l'intensità media, senza sacrificare l'energia di picco, le tre travi combinato vengono inviati attraverso un elettro-ottici modulatore (cella Pockel, il ConOptics) funziona come un selettore di impulsi, che ci permette di regolare la frequenza di ripetizione degli impulsi che arrivare al nostro campione e quindi l'intensità media.
9. I raggi laser vengono poi combinati insieme in un microscopio rovesciato con un obiettivo alto NA. L'obiettivo è tipicamente un acqua 60 X lenti dell'obiettivo con una apertura numerica (NA) di 1,2, che è stato corretto per l'aberrazione cromatica tutta la gamma di sintonizzabilità di OPO è nostra e il 1064 fascio nm. La stretta di messa a fuoco generato dalla lente dell'obiettivo alta NA consente la generazione più efficiente di segnali coerenti Raman sulla scala micron.
10. Le travi combinati sono espanse in modo da riempire troppo il retro-porto di l'obiettivo microscopio. Da un eccessivo riempimento del retro dell'obiettivo microscopio possiamo ottenere le migliori condizioni di messa a fuoco e quindi la migliore risoluzione spaziale nel nostro sistema microscopio.
11. La lente obiettivo del nostro microscopio è montato su un palco XYZ piezo che ci permette di ottenere immagini da raster-scanning le travi in ​​tutto il campione, simile a quello commerciale fascio-microscopi a scansione confocale.

2. L'uso di tre laser a impulsi brevi

L'utilizzo di tre risultati a breve impulsi laser nella produzione di diversi segnali CARS, dai vari combinations di due laser, così come 3-Color CARS e DR-FWM segnali dalla combinazione di tutti e tre i laser.

1. Le lunghezze d'onda dei segnali può mentire spettralmente vicini gli uni agli altri. Quando i segnali sono vicini tra loro può essere difficile separarli per l'analisi utilizzando filtri passa-banda fisse lunghezza d'onda e specchi dicroici. Per questo motivo i nostri segnali sono passati in uno spettrometro di immagini (SpectraPro 2300i, Acton Ricerca) che serve anche come un monocromatore efficiente per separare spazialmente segnali a diverse lunghezze d'onda.
2. Uno specchio a comando elettronico all'interno capovolgere lo spettrometro in posizione abbassata invia il segnale ad un retro-illuminato profondo esaurimento charge-coupled device (CCD) della fotocamera che fornisce informazioni spettroscopiche su tutta la gamma intero segnale e ci permette di identificare e ottimizzare le varie coerente segnali Raman.
3. Per selezionare il segnale con il quale vogliamo immagine che semplicemente ruotare la griglia all'interno dello spettrometro, utilizzando il forniti dal produttore controllo e acquisizione dati software (WinSpec, Princeton Instruments), al centro il picco di interesse sulla fotocamera CCD e quindi modificare il posizione dello specchio flip per reindirizzare il segnale ad una porta seconda uscita alla quale un singolo fotone valanga conteggio fotodiodo (APD) è stato allegato.
4. La lente obiettivo è quindi raster acquisiti e dei segnali registrati sul APD sono usati per generare un'immagine visualizzando il fotone count-rate per ogni pixel tramite il software di acquisizione dati (SymPhoTime, Picoquant GmbH, Berlino, Germania).
5. Ripetiamo questa procedura di imaging per ogni segnale coerente desiderato Raman che ci permette di confrontare i segnali durante la post-elaborazione.

3. Preparazione del campione

Al fine di ottenere immagini chiare e riproducibile una certa cura deve essere presa nella preparazione del campione.

1. I campioni sono in genere preparati su ~ 150 micron di spessore lamelle di vetro. Queste coprioggetto sono abbastanza sottile per consentire l'imaging ad alta risoluzione con il 1.2 NA obiettivi che sono tipicamente utilizzati.
2. Intrappolamento ottico di oggetti dielettrici può verificarsi quando la luce laser viene diffratta attraverso piccoli oggetti trasparenti. L'utilizzo di ben focalizzato, elevata potenza di picco, a breve raggi laser pulsato quindi possibile trascinare piccole cellule o batteri lungo, con conseguente immagini sfocate o macchiate. Per evitare ciò, può essere necessario immobilizzare il campione sulla superficie del vetrino di vetro in primo luogo applicando un sottile strato di poli-L-lisina da spin-coating.
3. Per le cellule in coltura di vetro piatti cultura fondo può essere utilizzato per l'imaging che permettono, senza la necessità di staccare le cellule dal loro piatti cultura la crescita delle cellule.
4. Per la dimostrazione di questo contributo abbiamo prima un deposito fissati in formaldeide e C. elegans verme nematode su un foglietto copertura in vetro.
5. Quindi aggiungere una goccia 20 ml di soluzione glucosata al 5 M deuterati al worm. La soluzione di glucosio deuterati offre una firma unica e forte background Raman.

4. Esempio di Analisi

Al fine di tenere adeguatamente sfruttare l'effetto valorizzazione doppiamente risonante gli spettri Raman di entrambi Raman-risonante sostanze devono essere noti.

1. Una volta che il campione è preparato sul vetrino che viene analizzato con un microscopio confocale Raman per ottenere le relative spettro Raman spontaneo ed identificare i picchi adeguati.
2. Per eseguire DR-CARS ci identifichiamo i luoghi spettrali della modalità tratto CH, tipicamente associate con i lipidi, e la modalità tratto CD, associato al glucosio deuterati, da 2845 centimetri ^-1 e 2121 centimetri ^-1 rispettivamente.
3. Coerente scattering Raman si ottiene quando la differenza di frequenza tra due laser corrisponde alla frequenza di una vibrazione molecolare. Messa a punto da uno OPO a 817 nm sarà sondare la centimetro 2845 ^-1 modalità CH quando combinato con il raggio laser 1064 nm e dalla messa a punto del OPO altro a 868 nm sarà sondare la centimetro 2121 ^-1 picco quando combinato con il fascio di 1064 nm .
4. Da raster-scanning il campione sul microscopio CARS ora possiamo osservare tre segnali Raman coerente di interesse. Un segnale AUTO sondare l'allungamento CH vibrazione, un segnale AUTO sondare la modalità tratto CD, e un DR-AUTO segnale sondaggio entrambi.
5. Selezioniamo ogni picco come descritto nella Sezione 2.3 e scattare una foto come descritto sopra.

5. Image Processing

Estrazione di informazioni aggiuntive sulla base di queste tre immagini ora richiede alcuni di elaborazione delle immagini abbastanza semplice.

1. Prima volta le immagini devono essere normalizzati. In teoria la normalizzazione può essere ottenuto contabili per l'intensità di ogni laser coinvolte in ogni processo di generazione del segnale. In pratica, tuttavia questo non sempre funziona, principalmente a causa della non uniforme risposta spettraledi specchi dicroici, rivelatori, e grate.
2. Un metodo pratico per la normalizzazione si basa sul fatto che nelle regioni in cui i lipidi puro dominano il segnale, la risonanza CD non dovrebbe contribuire ad uno qualsiasi degli segnale. Allo stesso modo, nelle regioni di soluzione di glucosio puro la risonanza CH non deve contribuire ad uno qualsiasi degli segnale. Con questo in mente, abbiamo normalizzare il DR-CARS immagine e l'immagine CARS ottenuto sulla risonanza CD della soluzione di glucosio deuterati ad una regione ben al di fuori della C. elegans worm che deve presentare nessuna risonanza CH.
3. Poi abbiamo identificare una regione all'interno del worm in CH-risonante immagine CARS che è ricco di lipidi e normalizzare alla regione corrispondente nel normalizzato DR-AUTO immagine. Per questo metodo funzioni correttamente assumiamo che profonde in questa regione non deuterati glucosio è presente. Questo è un presupposto sicuro in quanto i lipidi sono idrofobiche e non mescolare con la soluzione.
4. Ora, sottraendo il normalizzato CH-risonante immagine AUTO dal normalizzato DR-AUTO immagine che ci rimane solo la amplificato CD-risonante dei segnali.
5. Allo stesso modo sottraendo la normalizzato CD-risonante immagine AUTO dal normalizzato DR-FWM immagine che ci rimane solo il CH-risonanza amplificata del segnale.

6. Rappresentante Risultati

Figura 1: Schema di DR-CARS sistema di microscopia come descritto sopra.

Figura 2: immagine di una luce bianca C. verme elegans in soluzione glucosata deuterato preparato su un vetrino di vetro e pronto per l'imaging.

Figura 3:. Spettro Raman di acido oleico modificati (un acido grasso insaturo) che include una modifica alchino (un triplo legame carbonio carbonio gruppo) Le risonanze CH forte a 2845 centimetri ^-1 e la risonanza alchini a 2100 cm ^-1 sono entrambi ben isolato dalla regione di impronte digitali (la regione di picchi densamente imballato), che li rende marcatori ideali per l'imaging Raman coerenti.

Figura 4:. Spettro tipico di segnali coerenti Raman generati quando tre brevi impulsi laser si sovrappongono all'interno del campione Le frecce indicano il processo (i) responsabile per ogni segnale, come rappresentato da diagrammi di energia. Nei diagrammi qui frecce tratteggiate indicano i fotoni del laser e la OPO e le frecce indicano il segnale solido risultante. Le linee continue orizzontali indicano l'energia della vibrazione Raman e dare una rappresentazione visiva che, in DR-CARS, mescolando le stesse 3 fotoni in ingresso sonde contemporaneamente due diverse vibrazioni Raman.

Figura 5: I risultati tipici dalle immagini C. elegans worm utilizzando DR-AUTO e AUTO. La riga superiore utilizzato i tre segnali indicati in figura 4 per immagine un verme in una soluzione di glucosio deuterati. In seconda fila le immagini sono stati opportunamente normalizzati e in terza fila le immagini sono state prodotte differenza sottraendo ciascuna delle immagini CARS dal DR-CARS immagine.

Discussion

Spettroscopia Raman e Raman basato su immagini sono potenti strumenti emergenti nel campo delle scienze bio. Attualmente, questo è particolarmente vero per l'in vivo e in studio in vitro del metabolismo cellulare e disturbi metabolici di lavorazione e stoccaggio dei lipidi. La maggior parte dei bio-macromolecole contengono un gran numero di simili, obbligazioni per lo più a base di carbonio molecolare, in modo che gli spettri Raman ottenuti da cellule e gli organismi sono solitamente una convoluzione dei contributi da lipidi, proteine, acidi nucleici, zuccheri, lipidi, ecc sono relativamente facili per isolare da questi spettri complessi, a causa della loro tendenza a formare gocce dense o doppi strati e perché contengono lunghe catene con un gran numero di legami CH alifatici. La nostra capacità di isolare specifiche proteine, aminoacidi, RNA, o il DNA all'interno dell'ambiente cellulare complesso, tuttavia, è molto limitata. Ciò è particolarmente vero se queste molecole di interesse sono presenti solo a concentrazioni mM e al di sotto. Qui, la capacità di sondare deboli risonanze Raman utilizzando i nostri recente introduzione DR-AUTO tecnica di imaging differenza fornisce un approccio potenzialmente potente per la loro microanalisi chimica e di imaging. Certo, la parte più complicata di questo protocollo è l'allineamento e la sincronizzazione del sistema laser. Quando si inizia da zero, la sincronizzazione degli impulsi, cioè garantire che gli impulsi sono sovrapposte nel tempo, nonostante i diversi percorsi prendono può essere facilitato dall'uso di una autocorrelatore impulsi. Una volta che si sovrappongono spaziale e temporale si ottiene, AUTO e DR-CARS segnali devono essere facilmente rilevabile. Tuttavia, l'allineamento prima è spesso cruda, con conseguente segnali deboli. La pratica migliore per allineare il sistema bene è quello di generare segnali deboli inizialmente e poi per migliorare la potenza del segnale con delicatezza modificando gli specchi lungo ogni percorso e regolando la sovrapposizione temporale con le fasi di ritardo. Anche se lo spettrometro / monocromatore agisce come un diaframma molto efficiente per la luce ambiente il più pulito risultati possono essere raggiunti dal funzionamento del sistema con le luci della stanza spento e tende o tubi obiettivo di ridurre al minimo sfondo introdotta dalle varie fonti di luce di altri (ad esempio monitor di computer, spie luminose, i LED, ecc.)

La nostra particolare impostazione utilizza singolo fotone conteggio valanga fotodiodo (APD) rilevatori e correlate nel tempo conteggio singolo fotone (TCSPC) hardware per il rilevamento ^5. Questo ci permette di rilevare i segnali estremamente deboli con rumore relativamente basso, ma molti gruppi hanno trovato foto-moltiplicatore tubi (PMT) con guadagno variabile vantaggiosa quando si eseguono misure simili. Il vantaggio di PMT è che essi offrono guadagno variabile e hanno una zona di rilevamento molto più grande che può semplificare l'allineamento del rivelatore. Inoltre, la nostra impostazione utilizza fasi piezo per tradurre l'obiettivo al fine di ottenere la scansione del fascio. Il vantaggio di questo è che abbiamo la possibilità di tornare a qualsiasi punto all'interno dell'immagine acquisita in precedenza con un alto grado di accuratezza e di prendere misure aggiuntive, tra cui spontaneo spettri Raman. Altri gruppi hanno avuto successo utilizzando assemblee mirror di scansione, o addirittura intere unità di scansione confocale come il sistema Olympus FluoView, che offre immagini molto più veloce, ma è limitata nella sua capacità di restituire con precisione in posizioni arbitrarie all'interno di un'immagine.

Mettere a punto il laser per abbinare la risonanza Raman è anche un passo fondamentale che può richiedere qualche ottimizzazione. Anche se i picchi Raman si può conoscere l'intensità massima di picco spettrale ottenuti da DR-AUTO CARS e non corrisponde necessariamente al massimo del picco Raman spontaneo. Ciò è dovuto alla interferenza intrinseca di segnali generati da quattro-wave di miscelazione portando ad una non risonante segnale di fondo e auto, che distorce spettri AUTO rispetto alla spontanea spettri Raman. La posizione spettrale del picco del segnale CARS può essere calcolato, ma un approccio più pratico è quello di regolare il OPOS in diversi, piccoli passi spettrale attraverso la posizione prevista della risonanza Raman. Questo processo dovrebbe produrre un massimo chiaro. Infatti, per la massima sensibilità da DR-FWM sia risonanze deve essere sintonizzata a questa massima.

Un ultimo problema potenziale del DR-CARS approccio deve anche essere discussa, ovvero il modello DR-CARS segnale dipenderà da una distribuzione omogenea della molecola Raman-attivo di amplificazione. Per la maggior parte degli oggetti biologici, questo potrebbe essere la risonanza ampia OH dall'acqua, che è abbondante e quasi onnipresente. L'acqua è, comunque, esclusi dalle regioni idrofobiche con una cella, come gocce lipidiche, che porta una distorsione del segnale ottenuto quando si utilizza la risonanza acqua per amplificare le modalità dei lipidi. Nel nostro esempio, abbiamo utilizzato una soluzione di glucosio deuterati per generare un segnale facilmente rilevabili e abbondanti per il nostro campione biologico. Allo stesso modo, deuterati acqua o deuterati buffe biologicors, come d-HEPES potrebbero essere utilizzati. Nel nostro esempio, le goccioline lipidiche all'interno del C. verme elegans sono stati abbastanza piccolo per contenere sempre sia, la soluzione deuterati glucosio e lipidi all'interno del punto laser focalizzato del nostro sistema. Questo, tuttavia, non è generalmente vero. Un esempio particolare sarebbe adipociti, che generano gocce lipidiche piuttosto grandi nel loro citoplasma. Ciò significa che, ogni esperimento condotto con il DR-CARS tecnica richiede un'accurata preparazione ed esperimenti di controllo per verificare i risultati.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60X water immersion objective	Olympus Corporation	UPLSAPO 60XW
Inverted Microscope	Olympus Corporation	IX-71SIF-3
Pockels Cell	ConOptics	350-160
Picotrain pump Laser	HighQ	IC-1064-10000
Optical Parametric Oscillator	APE	Levante IR
1.5 Glass cover slips	Fisher Scientific	12-545-102 25cm-1
Half-wave plates	Thorlabs Inc.	AHWP05M-980
Polarizing Beam Splitter Cubes	Thorlabs Inc.	PBS052 or PBS053
Spectrometer/Monochromator	Princeton Instruments/Acton	Spectra Pro 2300i
CCD Camera	Princeton Instruments/Acton	PIXIS: 100B
Avalanche Photo Diode	PerkinElmer, Inc.	SPCM-AGR-14-12691
XYZ Piezo Stage	Physik Instruments	P 733-2CL P 721.CDQ	This is a combination of an XY stage and a Z objective holder
Dichroic Mirrors	Semrock	Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25	These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient.
Dichroic Mirror	Chroma Technology Corp.	Z830rdc	To combine the different near-infrared laser beams
TCSPC board	PicoQuant	Timeharp 200
Symphotime Imaging Software	PicoQuant
Matlab	Mathworks