يتم استخدام مزيج من ثلاثة واحد ليزر نابض قصيرة الطول الموجي لتوليد متماسكة لمكافحة ستوكس رامان نثر (السيارات) والسيارات ، مضاعفة الرنانة (DR – CARS). الفرق بين هذه الإشارات يوفر زيادة في الحساسية للخلاف من الصعب اكتشاف إشارات رامان متماسكة ، مما يتيح تصوير الذاريات رامان ضعيفة.
شهدت تماسكا تقنيات التصوير رامان زيادة كبيرة في النشاط على مدى العقد الماضي بسبب وعودهم لتمكين التسمية خالية التصوير الضوئي مع خصوصية عالية الجزيئية 1. حساسية هذه التقنيات ، ولكن ، العديد من الطلبات من حيث الحجم أضعف من مضان ، تتطلب ملي المولي 1،2 تركيزات الجزيئية. هنا ، نحن تصف تقنية يمكن المساعدة في الكشف عن تركيزات منخفضة من ضعف أو رامان الجزيئات النشطة عن طريق تضخيم الإشارة مع ذلك تم الحصول عليها من الذاريات رامان قوية أو وفيرة. تفاعل الليزر نابض قصيرة في عينة بيولوجية يولد مجموعة متنوعة من متماسكة اشارات تشتت رامان ، كل منها تحمل فريدة عن المعلومات الكيميائية العينة. عادة ، يتم استخدام واحد فقط من هذه الإشارات ، على سبيل المثال المتماسك رامان نثر المضادة للستوكس (السيارات) ، لتوليد صورة بينما يتم تجاهل الآخرين. ومع ذلك ، عندما يتم تجميع هذه الإشارات الأخرى ، بما في ذلك 3 ألوان السيارات وأربع موجة خلط (FWM) ، وبالمقارنة مع إشارة للسيارات ، يمكن استخراجها من الصعب على خلاف ذلك للكشف عن المعلومات 3. على سبيل المثال ، السيارات ، مضاعفة الرنانة (DR – CARS) هو نتيجة للتداخل البناء بين إشارتين الرنانة 4. نحن لشرح كيفية ضبط للأشعة الليزر الثلاثة المطلوبة لإنتاج السيارات DR – إشارات إلى 2845 سم -1 الاهتزاز تمتد CH في الدهون والاهتزاز 2120 سم -1 CD تمتد من جزيء deuterated (السكريات deuterated مثل الأحماض الدهنية ، الخ.) يمكن استخدامها لتحقيق كل من الأصداء رامان في وقت واحد. في ظل هذه الظروف ، بالإضافة إلى إشارات السيارات من كل الرنين ، مجتمعة DR – CARS إشارة التحقيق ولدت أيضا على حد سواء. نحن لشرح كيفية اكتشاف الفرق بين إشارة DR – السيارات وتضخيم إشارة من الاهتزاز وفيرة لجزيء يمكن استخدامه لتعزيز حساسية لضعف الإشارة. نظهر أيضا أن هذا النهج يمتد حتى إلى التطبيقات التي يتم إنشاؤها على حد سواء اشارات من جزيئات مختلفة ، مثل أن استخدام مثل إشارة قوية من رامان مذيب يمكن أن تعزز إشارة ضعيفة رامان لتمييع المذاب.
رامان التحليل الطيفي والتصوير رامان المستندة إلى أدوات قوية الناشئة في مجال العلوم البيولوجية. حاليا ، هذا صحيح لا سيما بالنسبة للفي الجسم الحي والدراسة في المختبر من الأيض الخلوي والاضطرابات الأيضية في معالجة وتخزين الدهون. معظم الجزيئات الحيوية تحتوي على عدد كبير من سندات مماثلة ، الجزيئية في معظمها تقوم على الكربون ، بحيث أطياف رامان تم الحصول عليها من خلايا الكائنات الحية وعادة ما تكون الإلتواء المساهمات من الدهون والبروتينات والأحماض النووية ، والسكريات ، والدهون غير ذلك من السهل نسبيا لعزل من هذه الأطياف المعقدة ، وذلك بسبب ميلها لتشكيل قطرات كثيفة وطبقات ثنائية أو لأنها تحتوي على سلاسل طويلة مع عدد كبير من السندات CH الأليفاتية. قدرتنا على عزل بروتينات معينة ، والأحماض الأمينية ، والجيش الملكي النيبالي ، أو الحمض النووي داخل الخلايا البيئة المعقدة ، مع ذلك ، محدودة جدا. هذا صحيح بصفة خاصة إذا كانت هذه الجزيئات من الفائدة موجودة فقط في تركيزات ميكرومتر وما دونها. هنا ، والقدرة على تحقيق الاستفادة من ضعف رامان الأصداء التي أدخلت حديثا لدينا فرق التصوير DR – السيارات تقنية يوفر نهجا قوية لتحليل مجهري الكيميائي والتصوير. باعتراف الجميع ، والجزء الأكثر تعقيدا من هذا البروتوكول هو التوافق والتزامن لنظام ليزر. عندما تبدأ من الصفر ، وتزامن البقول ، وضمان أن يتم أي تداخل النبضات في الوقت المناسب على الرغم من أنها تأخذ مسارات مختلفة يمكن أن تيسره استخدام autocorrelator النبض. ويتحقق التداخل المكاني والزماني مرة واحدة والسيارات وDR – السيارات إشارات ينبغي كشفها بسهولة. ومع ذلك ، فإن المحاذاة الأول هو الغالب الخام ، مما أدى إلى إشارات ضعيفة. أفضل الممارسات لمواءمة هذا النظام بشكل جيد يهدف الى توليد إشارات ضعيفة في البداية ومن ثم لتحسين قوة الإشارة التي اللف برفق المرايا على طول كل المسار وضبط التداخل الزمني باستخدام مراحل تأخير. على الرغم من تحول أعمال مطياف / مستوحد اللون كما يربك فعالة جدا للضوء الغرفة يمكن تحقيق نتائج أنظف من خلال تشغيل النظام مع أضواء الغرفة قبالة والستائر أو أنابيب للحد من عدسة خلفية عرضه مصادر الضوء المختلفة الأخرى (مثل شاشات الكمبيوتر ، أضواء المؤشر ، المصابيح ، إلخ).
الإعداد لدينا خاصة ويستخدم الفوتون المفرد عد سيل الصور ديود (APD) للكشف عن وتستغرق وقتا ترتبط العد فوتون واحد (TCSPC) أجهزة للكشف عن 5. وهذا يمكننا من الكشف عن اشارات ضعيفة للغاية مع ضوضاء منخفضة نسبيا لكن جماعات كثيرة وجدت الصور المضاعف أنابيب (PMT) مع الحصول على فائدة متغير عند إجراء القياسات مماثلة. ميزة لPMT هو أنها توفر كسب متغير ويكون لها مجال الكشف عن أكبر بكثير مما يمكن تبسيط محاذاة كاشف. بالإضافة إلى ذلك ، يستخدم الإعداد لدينا مراحل بيزو لترجمة موضوعية من أجل تحقيق المسح شعاع. وميزة هذا هو أن لدينا القدرة على العودة الى أي بقعة داخل الصورة الممسوحة ضوئيا من قبل مع وجود درجة عالية من الدقة وأخذ قياسات إضافية بما في ذلك أطياف رامان عفوية. وكانت الجماعات الأخرى الناجحة باستخدام مرآة المجالس المسح الضوئي ، أو حتى كامل وحدات المسح مبائر مثل نظام FluoView أوليمبوس ، والذي يقدم التصوير أسرع بكثير ولكنها محدودة في قدرتها على العودة إلى مواقع على وجه التحديد التعسفي داخل صورة.
توليف ليزر لمطابقة الرنين رامان هو أيضا خطوة الحرجة التي قد تتطلب بعض التحسين. رغم أنه قد يكون معروفا القمم رامان أقصى ذروة الكثافة الطيفية التي تم الحصول عليها من DR – السيارات والسيارات لا تتوافق بالضرورة إلى أقصى ذروة رامان عفوية. هذا ومن المقرر أن تدخل جوهري من الإشارات التي تولدها أربع موجة خلط يؤدي إلى إشارة الخلفية غير الرنانة والسيارات ، الأمر الذي يشوه السيارات أطياف أطياف رامان النسبي للعفوية. ويمكن حساب الموقع الطيفية للذروة إشارة السيارات ، ولكن اتباع نهج أكثر واقعية هو توليف OPOS في عدة خطوات صغيرة الطيفية عبر الموقع المتوقعة من الرنين رامان. هذه العملية يجب أن تسفر عن الحد الأقصى واضحة. في الواقع ، لا بد لأكبر من الحساسية DR – FWM يمكن ضبطها سواء الأصداء إلى هذا الحد الأقصى.
مشكلة واحدة محتملة للنهج مشاركة DR – السيارات أيضا أن تتم مناقشة أي إشارة DR – السيارات سوف يعتمد على توزيع متجانس للجزيء رامان النشطة تضخيم. لكائنات معظم البيولوجية ، وهذا يمكن أن يكون جيدا OH صدى واسع من المياه ، وهي وفيرة ومنتشرة في كل مكان تقريبا. هو والمياه ومع ذلك ، يستبعد من المناطق مسعور مع خلية ، مثل قطرات الدهون ، مما يؤدي إلى تشويه الإشارات التي تم الحصول عليها باستخدام الرنين عندما المياه لتضخيم وسائط الدهون. في مثالنا ، وقد استخدمنا محلول الجلوكوز deuterated لتوليد إشارة يمكن كشفها بسهولة وفيرة لدينا عينة بيولوجية. وبالمثل ، deuterated الماء أو deuterated buffe البيولوجيةويمكن استخدام التمرير ، مثل د HEPES. في مثالنا ، والدهون داخل قطرات C. وايليجانس دودة صغيرة بما يكفي لاحتواء كل الأحوال ، فإن الحل deuterated الجلوكوز والدهون في بقعة الليزر المركزة لنظامنا. هذا ، ومع ذلك ، لا ينطبق عموما. ومن الأمثلة سيما أن الخلايا الشحمية ، التي تولد قطرات الدهون بدلا كبيرة داخل السيتوبلازم بهم. وهذا يعني ، أي التجربة التي أجريت مع تقنية DR – السيارات يتطلب إعدادا دقيقا ومراقبة التجارب للتحقق من النتائج.
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر إيوان Schie وسيباستيان Wachsmann – Hogiu لما قدموه من مساهمات في تطوير تقنية DR – السيارات. تايلر أسبوعين يقر الدعم المقدم من برنامج الباحث لورنس من مختبر لورانس ليفرمور. توماس Huser تشعر بالامتنان للدعم من رابطة القلب الأميركية من خلال برنامج المنح في والمعونة. كما أيد هذا العمل في جزء من التمويل من مؤسسة العلوم الوطنية. ويدير مركز بيوفوتونيك ، وجبهة الخلاص الوطني ومركز علوم التكنولوجيا ، من جامعة كاليفورنيا في ديفيز ، في إطار الاتفاق التعاوني رقم 0120999 PHY. ومن المسلم به أيضا دعما من مركز العلوم السريرية UCD بالحركة تحت رقم UL1 RR024146 منحة من المركز الوطني لبحوث الموارد (NCRR).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
60X water immersion objective | Olympus | UPLSAPO 60XW | ||
Inverted Microscope | Olympus | IX-71SIF-3 | ||
Pockels Cell | ConOptics | 350-160 | ||
Picotrain pump Laser | HighQ | IC-1064-10000 | ||
Optical Parametric Oscillator | APE | Levante IR | ||
1.5 Glass cover slips | Fisher Scientific | 12-545-102 25cm-1 | ||
Half-wave plates | Thor Labs | AHWP05M-980 | ||
Polarizing Beam Splitter Cubes | Thor Labs | PBS052 or PBS053 | ||
Spectrometer/Monochromator | PI Acton | Spectra Pro 2300i | ||
CCD Camera | PI Acton | PIXIS: 100B | ||
Avalanche Photo Diode | Perkin Elmer | SPCM-AGR-14-12691 | ||
XYZ Piezo Stage | Physik Instruments | P 733-2CL P 721.CDQ |
This is a combination of an XY stage and a Z objective holder | |
Dichroic Mirrors | Semrock | Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25 |
These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient. | |
Dichroic Mirror | Chroma | Z830rdc | To combine the different near-infrared laser beams | |
TCSPC board | PicoQuant | Timeharp 200 | ||
Symphotime Imaging Software | PicoQuant | |||
Matlab | Mathworks |