Una combinazione di tre singola lunghezza d'onda a breve impulsi laser viene utilizzato per generare coerente anti-Stokes scattering Raman (CARS) e doppiamente AUTO-risonante (DR-CARS). La differenza tra questi segnali fornisce maggiore sensibilità perché altrimenti difficili da individuare coerenti segnali Raman, che consente l'imaging di debole dispersori Raman.
Coerente tecniche di imaging Raman hanno visto un drammatico aumento delle attività nell'ultimo decennio a causa della loro promessa di permettere l'etichetta senza l'imaging ottico ad alta specificità molecolare 1. La sensibilità di queste tecniche, tuttavia, è molti ordini di grandezza più debole di fluorescenza, che richiedono milli-molare 1,2 molecolare concentrazioni. Qui, descriviamo una tecnica che può consentire di rilevare basse concentrazioni di debole o di Raman-attivo molecole, amplificando il loro segnale con quello ottenuto da dispersori Raman forti o abbondanti. L'interazione di brevi impulsi laser in un campione biologico genera una varietà di segnali coerenti scattering Raman, ognuno dei quali portano informazioni uniche sulla chimica del campione. In genere, solo uno di questi segnali, ad esempio coerente di lotta alla stokes scattering Raman (CARS), viene usato per generare un'immagine mentre gli altri vengono eliminati. Tuttavia, quando questi altri segnali, di cui 3 colori CARS e quattro-wave mixing (FWM), sono raccolti e confrontati con il segnale di CARS, altrimenti difficili da rilevare informazioni possono essere estratte 3. Per esempio, AUTO doppiamente risonante (DR-AUTO) è il risultato di interferenza costruttiva tra i due segnali di risonanza 4. Noi dimostrare come messa a punto dei tre laser necessaria per produrre DR-CARS segnali al centimetro 2845 -1 vibrazioni tratto CH in lipidi e il CM 2120 -1 vibrazioni CD allungamento di una molecola deuterato (ad esempio zuccheri deuterati, acidi grassi, ecc) può essere utilizzato per sondare sia risonanze Raman contemporaneamente. In queste condizioni, in aggiunta ai segnali CARS da ogni risonanza, un combinato DR-AUTO segnale sondaggio sia anche generato. Dimostriamo come rilevare la differenza tra il modello DR-CARS segnale e il segnale da amplificare le vibrazioni di una molecola abbondante può essere utilizzato per migliorare la sensibilità per il segnale più debole. Abbiamo inoltre dimostrato che questo approccio si estende anche ad applicazioni dove si generano i due segnali di molecole diverse, in modo che ad esempio utilizzando il forte segnale Raman di un solvente può migliorare il segnale debole Raman di un soluto diluito.
Spettroscopia Raman e Raman basato su immagini sono potenti strumenti emergenti nel campo delle scienze bio. Attualmente, questo è particolarmente vero per l'in vivo e in studio in vitro del metabolismo cellulare e disturbi metabolici di lavorazione e stoccaggio dei lipidi. La maggior parte dei bio-macromolecole contengono un gran numero di simili, obbligazioni per lo più a base di carbonio molecolare, in modo che gli spettri Raman ottenuti da cellule e gli organismi sono solitamente una convoluzione dei contributi da lipidi, proteine, acidi nucleici, zuccheri, lipidi, ecc sono relativamente facili per isolare da questi spettri complessi, a causa della loro tendenza a formare gocce dense o doppi strati e perché contengono lunghe catene con un gran numero di legami CH alifatici. La nostra capacità di isolare specifiche proteine, aminoacidi, RNA, o il DNA all'interno dell'ambiente cellulare complesso, tuttavia, è molto limitata. Ciò è particolarmente vero se queste molecole di interesse sono presenti solo a concentrazioni mM e al di sotto. Qui, la capacità di sondare deboli risonanze Raman utilizzando i nostri recente introduzione DR-AUTO tecnica di imaging differenza fornisce un approccio potenzialmente potente per la loro microanalisi chimica e di imaging. Certo, la parte più complicata di questo protocollo è l'allineamento e la sincronizzazione del sistema laser. Quando si inizia da zero, la sincronizzazione degli impulsi, cioè garantire che gli impulsi sono sovrapposte nel tempo, nonostante i diversi percorsi prendono può essere facilitato dall'uso di una autocorrelatore impulsi. Una volta che si sovrappongono spaziale e temporale si ottiene, AUTO e DR-CARS segnali devono essere facilmente rilevabile. Tuttavia, l'allineamento prima è spesso cruda, con conseguente segnali deboli. La pratica migliore per allineare il sistema bene è quello di generare segnali deboli inizialmente e poi per migliorare la potenza del segnale con delicatezza modificando gli specchi lungo ogni percorso e regolando la sovrapposizione temporale con le fasi di ritardo. Anche se lo spettrometro / monocromatore agisce come un diaframma molto efficiente per la luce ambiente il più pulito risultati possono essere raggiunti dal funzionamento del sistema con le luci della stanza spento e tende o tubi obiettivo di ridurre al minimo sfondo introdotta dalle varie fonti di luce di altri (ad esempio monitor di computer, spie luminose, i LED, ecc.)
La nostra particolare impostazione utilizza singolo fotone conteggio valanga fotodiodo (APD) rilevatori e correlate nel tempo conteggio singolo fotone (TCSPC) hardware per il rilevamento 5. Questo ci permette di rilevare i segnali estremamente deboli con rumore relativamente basso, ma molti gruppi hanno trovato foto-moltiplicatore tubi (PMT) con guadagno variabile vantaggiosa quando si eseguono misure simili. Il vantaggio di PMT è che essi offrono guadagno variabile e hanno una zona di rilevamento molto più grande che può semplificare l'allineamento del rivelatore. Inoltre, la nostra impostazione utilizza fasi piezo per tradurre l'obiettivo al fine di ottenere la scansione del fascio. Il vantaggio di questo è che abbiamo la possibilità di tornare a qualsiasi punto all'interno dell'immagine acquisita in precedenza con un alto grado di accuratezza e di prendere misure aggiuntive, tra cui spontaneo spettri Raman. Altri gruppi hanno avuto successo utilizzando assemblee mirror di scansione, o addirittura intere unità di scansione confocale come il sistema Olympus FluoView, che offre immagini molto più veloce, ma è limitata nella sua capacità di restituire con precisione in posizioni arbitrarie all'interno di un'immagine.
Mettere a punto il laser per abbinare la risonanza Raman è anche un passo fondamentale che può richiedere qualche ottimizzazione. Anche se i picchi Raman si può conoscere l'intensità massima di picco spettrale ottenuti da DR-AUTO CARS e non corrisponde necessariamente al massimo del picco Raman spontaneo. Ciò è dovuto alla interferenza intrinseca di segnali generati da quattro-wave di miscelazione portando ad una non risonante segnale di fondo e auto, che distorce spettri AUTO rispetto alla spontanea spettri Raman. La posizione spettrale del picco del segnale CARS può essere calcolato, ma un approccio più pratico è quello di regolare il OPOS in diversi, piccoli passi spettrale attraverso la posizione prevista della risonanza Raman. Questo processo dovrebbe produrre un massimo chiaro. Infatti, per la massima sensibilità da DR-FWM sia risonanze deve essere sintonizzata a questa massima.
Un ultimo problema potenziale del DR-CARS approccio deve anche essere discussa, ovvero il modello DR-CARS segnale dipenderà da una distribuzione omogenea della molecola Raman-attivo di amplificazione. Per la maggior parte degli oggetti biologici, questo potrebbe essere la risonanza ampia OH dall'acqua, che è abbondante e quasi onnipresente. L'acqua è, comunque, esclusi dalle regioni idrofobiche con una cella, come gocce lipidiche, che porta una distorsione del segnale ottenuto quando si utilizza la risonanza acqua per amplificare le modalità dei lipidi. Nel nostro esempio, abbiamo utilizzato una soluzione di glucosio deuterati per generare un segnale facilmente rilevabili e abbondanti per il nostro campione biologico. Allo stesso modo, deuterati acqua o deuterati buffe biologicors, come d-HEPES potrebbero essere utilizzati. Nel nostro esempio, le goccioline lipidiche all'interno del C. verme elegans sono stati abbastanza piccolo per contenere sempre sia, la soluzione deuterati glucosio e lipidi all'interno del punto laser focalizzato del nostro sistema. Questo, tuttavia, non è generalmente vero. Un esempio particolare sarebbe adipociti, che generano gocce lipidiche piuttosto grandi nel loro citoplasma. Ciò significa che, ogni esperimento condotto con il DR-CARS tecnica richiede un'accurata preparazione ed esperimenti di controllo per verificare i risultati.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare Iwan Schie e Sebastian Wachsmann-Hogiu per il loro contributo nello sviluppo della DR-CARS tecnica. Settimane Tyler riconosce il sostegno dal Programma Scholar Lawrence Lawrence Livermore National Laboratory. Thomas Huser è grata per il supporto della American Heart Association mediante la concessione in Aid programma. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un finanziamento della National Science Foundation. Il Centro per Biofotonica, un NSF Scienza e Tecnologia Center, è gestito dalla University of California, Davis, ai sensi del Contratto Cooperativa PHY n. 0120999. Il supporto è riconosciuto anche dal Centro di Scienze Cliniche UCD traslazionale con il numero concedere UL1 RR024146 dal Centro Risorse Nazionale per la Ricerca (NCRR).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
60X water immersion objective | Olympus | UPLSAPO 60XW | ||
Inverted Microscope | Olympus | IX-71SIF-3 | ||
Pockels Cell | ConOptics | 350-160 | ||
Picotrain pump Laser | HighQ | IC-1064-10000 | ||
Optical Parametric Oscillator | APE | Levante IR | ||
1.5 Glass cover slips | Fisher Scientific | 12-545-102 25cm-1 | ||
Half-wave plates | Thor Labs | AHWP05M-980 | ||
Polarizing Beam Splitter Cubes | Thor Labs | PBS052 or PBS053 | ||
Spectrometer/Monochromator | PI Acton | Spectra Pro 2300i | ||
CCD Camera | PI Acton | PIXIS: 100B | ||
Avalanche Photo Diode | Perkin Elmer | SPCM-AGR-14-12691 | ||
XYZ Piezo Stage | Physik Instruments | P 733-2CL P 721.CDQ |
This is a combination of an XY stage and a Z objective holder | |
Dichroic Mirrors | Semrock | Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25 |
These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient. | |
Dichroic Mirror | Chroma | Z830rdc | To combine the different near-infrared laser beams | |
TCSPC board | PicoQuant | Timeharp 200 | ||
Symphotime Imaging Software | PicoQuant | |||
Matlab | Mathworks |