3つのシングル波長短パルスレーザの組み合わせは、コヒーレントアンチストークスラマン散乱(CARS)と二重共鳴CARSを(DR – CARS)を生成するために使用されます。これらの信号の差は弱いラマン散乱体のイメージングを可能にする、コヒーレントラマン信号を検出することが難しいために強化された感度を提供します。
コヒーレントラマンイメージング技術は、起因する高分子特異性1とラベルフリー光イメージングを可能にするという約束に過去10年間の活動の劇的な増加を見てきました。これらの技術の感度は、しかし、ミリモルの分子の濃度の1,2を必要とする、蛍光より弱い数桁です。ここで、我々は、強いまたは豊富なラマン散乱から得られたものと、その信号を増幅することでラマン活性分子の弱いまたは低濃度の検出を有効にすることができます技法を説明します。生体試料中の短パルスレーザの相互作用は、サンプル約ユニークな化学物質の情報を運ぶそれぞれのコヒーレントラマン散乱信号、様々な生成。通常は、これらの信号、例えば、コヒーレントアンチストークスラマン散乱(CARS)、その中から1つだけを、他は破棄されている間画像を生成するために使用されます。ただし、これらの他の信号は、を含む3色のCARSと四光波混合(FWM)は、収集され、CARS信号と比較して、情報を検出することが難しい3を抽出することができます。例えば、二重共鳴CARSは(DR – CARS)2つの共振信号4との間の建設的干渉の結果である。我々は示す方法で脂質の2845センチメートル-1 CHの伸縮振動と重水素分子(例えば重水素化糖、脂肪酸、など)の2120センチメートル-1 CD伸縮振動にDR – CARS信号を生成するために必要な3つのレーザーのチューニング同時に両方のラマン共鳴をプローブするために利用することができます。これらの条件下で、それぞれの共鳴からのCARS信号に加えて、両方のプローブを組み合わせたDR – CARS信号も生成されます。 DR – CARS信号と弱い信号に対する感度を高めるために使用できる豊富な分子の振動から増幅信号との差を検出する方法私達は示しています。我々はさらに、このアプローチはさらに溶剤の強いラマンシグナルを使用して例えば、希薄な溶質の弱いラマン信号を高めることができるように、両方の信号が別の分子から生成されるアプリケーションに拡張することを示している。
ラマン分光法とラマンベースのイメージングは、バイオサイエンスの強力な新しいツールです。現在のところ、これはin vivo及び脂質の処理と保管の細胞の代謝と代謝性疾患のin vitro試験のために特に当てはまります。ほとんどの生体高分子は、細胞および生物から得られたラマンスペクトルは、通常、脂質、タンパク質、核酸、糖からの貢献の畳み込みになるように、同じような、ほとんどが炭素ベースの分子結合の多数を含んでいる、など脂質が比較的容易であるために密集した小滴または二重層を形成する傾向があるから、彼らは脂肪族CH結合の数が多いと拡張されたチェーンが含まれているため、これらの複雑なスペクトルから隔離する。複雑な細胞環境内で特定のタンパク質、アミノ酸、RNA、またはDNAを単離する当社の能力は、しかしながら、非常に限られている。興味のこれらの分子は以下のみμM濃度で存在している場合は特にそうです。ここで、私たちの新しく導入されたDR – CARS差イメージング技術を利用した弱いラマン共鳴を調べる機能は、それらの化学的微量分析やイメージングのための潜在的に強力なアプローチを提供します。確かに、このプロトコルの最も複雑な部分は、レーザーシステムのアライメントおよび同期です。ゼロから始めるときは、パルスの同期は、すなわちパルスを彼らが取る別のパスにもかかわらず、時間に重なっていることを保証することはパルスの自己相関を使用することによって促進することができます。一度空間的および時間的重なりが達成され、CARSとDR – CARS信号は、容易に検出可能なはずです。ただし、最初のアラインメントが弱い信号で、その結果、多くの場合、原油です。このシステムを揃えるためのベストプラクティスは、よく最初に微弱な信号を生成し、その後穏やかに微調整することにより、各パスに沿ってミラーと遅延段を使用して時間的重複を調整して信号強度を改善することです。部屋のライトのための非常に効率的なバッフルのような分光器/分光器の行為は、もののきれいな結果が他の様々な光源(例えば、コンピュータのモニタ、によって導入された背景を最小限に抑えるためにオフに部屋の照明を使用してシステムを操作することにより、カーテンやレンズチューブを達成することができますインジケータライト、LEDを、等)。
私たちの特定の設定は、シングルフォトンカウンティングのアバランシェフォトダイオード(APD)検出器と検出5時間相関単一光子計数(TCSPC)ハードウェアを利用しています。これは、私たちは比較的低いノイズが多くのグループが同様の測定を行う有利な可変利得を持つ光電子増倍管(PMTの)を発見したとの非常に弱い信号を検出することができます。 PMTのの利点は、可変ゲインを提供し、検出器の配置を簡素化することができるより大きな検出面積を持っていることです。さらに、我々のセットアップは、ビーム走査を実現するために、客観的に変換するピエゾステージを利用しています。これの利点は、我々は高い精度で以前にスキャンした画像内の任意の場所に戻って、自発ラマンスペクトルを含む追加の測定を行う能力を持っているということです。他のグループは、走査ミラーアセンブリ、またはそのようなはるかに高速イメージングを提供していますが、正確に画像内の任意の位置に戻るには、その能力に制限されているオリンパスFluoViewシステム、などであっても全体の走査型共焦点ユニットを利用して成功している。
ラマン共鳴に一致するようにレーザーのチューニングにもいくつかの最適化を必要とするかもしれない重要なステップです。ラマンピークが知られていることがありますが、DR – CARSとCARSから得られる最大のスペクトルのピーク強度が必ずしも自発ラマンピークの最大値に対応していません。これは、自発ラマンスペクトルの相対CARSスペクトルを歪める非共鳴バックグラウンド信号とCARS、につながる四波混合によって生成される信号の本質的な干渉によるものです。 CARS信号のピークのスペクトル位置は計算が、より実用的なアプローチは、ラマン共鳴の予想される場所で、いくつかの、小さなスペクトルのステップでOPOSを調整することですすることができます。このプロセスは、明確な最大値をもたらす必要があります。実際には、DR – FWMから最高感度のために両方の共鳴は、この最大値に調整する必要があります。
DR – CARSのアプローチの1つの最後の潜在的な問題も議論しなければならない、すなわちDR – CARS信号がラマン活性増幅分子の均一な分布に依存します。ほとんどの生物学的なオブジェクトの場合、これはよく豊富で、ほぼどこにでもある水から幅広いOHの共鳴、可能性があります。水は、しかし、脂質のモードを増幅するために水の共鳴を利用したときに得られる信号の歪みをリードするような脂肪滴として細胞、、との疎水性領域から除外されます。この例では、我々の生体試料のための容易に検出可能と豊富な信号を生成するために重水素化グルコースのソリューションを使用している。同様に、水を重水素化や生物学的buffe重水素化このようなD – HEPESなどのRSは、使用することができる。 C.内この例では、脂肪滴elegansのワームは 、常に我々のシステムの集束レーザスポット内に、重水素化グルコース溶液と脂質の両方を含むのに十分小さかった。これは、しかし、一般的には真ではありません。特定の例では、それらの細胞質内ではなく、大きな脂肪滴を生成する脂肪細胞、であろう。この手段は、DR – CARS法で実施したどんな実験では、結果を検証するために慎重な準備と対照実験が必要です。
The authors have nothing to disclose.
我々は、DR – CARS法の開発に貢献してイワンSchieとセバスチャンWachsmann – Hogiuに感謝したいと思います。タイラーの週はローレンスリバモア国立研究所からのローレンスScholarのプログラムによるサポートを認めている。トーマスHuserは、補助金プログラムを通じて米国心臓協会からの支援に感謝しています。この作品は、全米科学財団からの資金によって部分的にサポートされていました。バイオフォトニクス、NSF科学技術センター、研究センターが協力協定第PHY 0120999の下、デイビス、カリフォルニア大学によって管理されます。サポートはまた、研究資源(NCRR)のためのナショナルセンターからの助成金番号UL1 RR024146下UCD臨床トランスレーショナル科学センターから認められています。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
60X water immersion objective | Olympus | UPLSAPO 60XW | ||
Inverted Microscope | Olympus | IX-71SIF-3 | ||
Pockels Cell | ConOptics | 350-160 | ||
Picotrain pump Laser | HighQ | IC-1064-10000 | ||
Optical Parametric Oscillator | APE | Levante IR | ||
1.5 Glass cover slips | Fisher Scientific | 12-545-102 25cm-1 | ||
Half-wave plates | Thor Labs | AHWP05M-980 | ||
Polarizing Beam Splitter Cubes | Thor Labs | PBS052 or PBS053 | ||
Spectrometer/Monochromator | PI Acton | Spectra Pro 2300i | ||
CCD Camera | PI Acton | PIXIS: 100B | ||
Avalanche Photo Diode | Perkin Elmer | SPCM-AGR-14-12691 | ||
XYZ Piezo Stage | Physik Instruments | P 733-2CL P 721.CDQ |
This is a combination of an XY stage and a Z objective holder | |
Dichroic Mirrors | Semrock | Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25 |
These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient. | |
Dichroic Mirror | Chroma | Z830rdc | To combine the different near-infrared laser beams | |
TCSPC board | PicoQuant | Timeharp 200 | ||
Symphotime Imaging Software | PicoQuant | |||
Matlab | Mathworks |