절연, 강화하고, Medulloblastoma의 줄기 세포의 유지 보수
Summary
이 프로토콜은 절연, 강화하고, 이소성 소닉 헤지 호그 경로 활동과 돌연변이 생쥐에서 파생된 medulloblastoma 종양의 줄기 세포의 유지 보수를 설명합니다.
Abstract
뇌 종양은 tumorigenesis의 근본 원인 아르 줄기 세포의 작은 인구를 보유하기 위해 제안되었습니다. Neurosphere의 assays는 일반적으로 정상과 tumorous 조직에서 추출한 포함 신경 줄기 세포의 특성을 연구하기 위해 채택되었습니다. 그러나, 분화 및 세포 사망의 감지할 수있을 정도의 금액은 문화 매체 영역을 합산 내의 모든 세포의 접근성 등 하위 최적의 상태로 가능성 때문에 교양 neurospheres에서 흔히 있습니다.
Medulloblastoma, 가장 일반적인 소아 CNS 종양은 그 빠른 진행과 디즈멀 임상 결과와 전체 뇌 – 척추 축을 따라 확산 경향이 특징입니다. Medulloblastoma은 각각 1 20 %와 아동기에 intracranial 및 사후 포사 종양의 40 %에 대한 회계, 소뇌의 neuroepithelial 종양이다. 그것은 지금은 잘 쉬 신호는 소뇌 발달 2-4 중 소뇌 과립 신경 세포의 엽 성의 전구 물질 (CGNPs)의 확산을 자극한다는 걸 입증합니다. 쉿 경로가 constitutively 활성화되는 마우스 모델을 사용하여 많은 연구가, medulloblastoma 5-9로 쉬 신호를 연결했습니다.
최근 보고서는 Patched1 LacZ / + 마우스에서 파생된 medulloblastoma 세포의 일부가 종양 10 시작하고 propogating 능력이 암 줄기 세포,있는 것으로 나타났습니다. 여기서 우리는 효율적인 방법 Smoothened에 돌연변이 (11, hereon가 SmoM2로 함), 쉬를 위해 중요합니다 GPCR로 인해 constitutively 활성화 쉬 경로와 medulloblastoma의 여러 마우스 모델에서 파생된 종양 줄기 세포를 분리 풍부 및 유지 보수를 설명 경로 활성화. 모든 격리된 medulloblastoma 조직에서 우리는 많은 높은 proliferative 식민지를 설정할 수 있었다. 견고 같은 Nestin 및 Sox2 등 여러 신경 줄기 세포의 마커를 표현이 세포는, 일련 구절을 받다 (20보다 큰)과 clonogenic되었습니다 수 있습니다. 이러한 교양 종양의 줄기 세포가 줄기 세포의 성장을 좋아하는 조건에서 양식 때 세포질 비율이 높은 핵과 자주 bipoar 비교적 작은 동안, 그들은 극적으로, 그들의 형태를 변경 여러 세포 프로세스를 확장 평평하고 세포로 전환시 세포주기에서 전학을 가겠다고 문화 매체 10 % 태아 소 혈청과 보완. 더 중요한 것은, 이러한 종양 줄기 세포가 Tuj1로 차별 + 또는 NeuN + 뉴런, GFAP + astrocytes 및 CNPase + oligodendrocytes, 따라서 그들의 멀티 힘을 강조. 또한, 이들 세포는 orthotopically 호스트 마우스에 이식하면 보조 medulloblastomas을 전파 수 있었다.
Protocol
Discussion
우리는 constitutively 적극적인 헤지 호그 신호와 돌연변이 생쥐에서 가져온 기본 종양 조직에서 medulloblastoma의 줄기 세포를 분리 풍부하고 유지하는 효율적인 방법을 설명합니다. 우리는 성공적으로 건강한 종양의 줄기 세포 라인을 확립 한 중요한 단계는 기본 종양 조직의 분리시 사용되는 Accutase 치료되고있는 것으로 나타났습니다. 우리의 경험에서 때 소뇌에서 첫번째 dissociating 종양 조직, 37에?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 밴더빌트 – 잉그램 암 센터 지원 그랜트 (P30 CA068485), 아동 뇌종양 재단과 국립 보건원 (NS042205)에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | ||
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml | |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X | |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X | |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% | |
| Gelatin | Sigma | G1393 | 0.1% | |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM | |
| Primaria dishes | Fisher | 087724C | ||
| Sox2 antibody | Millipore | MAB4343 | Mouse, 1:1000 | |
| Nestin antibody | DSHB | rat401 | Mouse, 1:200 | |
| YFP antibody | Molecular Probes | A11122 | Rabbit, 1:2000 | |
| GFAP antibody | Neuromics | CH22102 | Chicken, 1:1000 | |
| Tuj1 antibody | Sigma | T5076 | Mouse, 1:2000 | |
| NeuN antibody | Millipore | MAB377 | Mouse, 1:2000 | |
| CNPase antibody | Millipore | MAB326 | Mouse, 1:1000 |
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