Summary
Dit protocol beschrijft de isolatie, verrijking en het onderhoud van medulloblastoom tumor stamcellen uit mutante muizen met ectopische Sonic Hedgehog pathway activiteit.
Abstract
Hersentumoren zijn voorgesteld om een kleine populatie van stamcellen die zijn de oorzaak van het ontstaan van tumoren bezitten. Neurosphere assays zijn over het algemeen genomen de aard van neurale stamcellen, waaronder die zijn afgeleid van normale en tumor weefsel te bestuderen. Echter, aanzienlijke hoeveelheden van differentiatie en celdood komen vaak voor bij gekweekte neurospheres waarschijnlijk te wijten aan sub-optimale conditie, zoals de toegankelijkheid van alle cellen binnen het werkingsgebied van aggregaten kweekmedium.
Medulloblastoom, de meest voorkomende tumor bij kinderen CNS, wordt gekenmerkt door zijn snelle progressie en de neiging zich te verspreiden langs de gehele hersen-spinale as met sombere klinische uitkomst. Medulloblastoom is een neuro-epitheliale tumor van het cerebellum, goed voor 20% en 40% van de intracraniële en posterior fossa tumor in de kindertijd, respectievelijk 1. Het is nu bekend dat Shh signalering de proliferatie van cerebellaire granule neuron precursoren (CGNPs) stimuleert tijdens de ontwikkeling van het cerebellum 2-4. Tal van studies met behulp van muismodellen, waarin de Shh pad constitutief geactiveerd is, zijn gekoppeld Shh signalering met medulloblastoom 5-9.
Een recent rapport heeft aangetoond dat een subset van medulloblastoom cellen afkomstig van Patched1 LacZ / + muizen zijn kanker stamcellen, die in staat zijn het initiëren en propogating tumoren 10. Hier beschrijven we een efficiënte methode te isoleren, te verrijken en te onderhouden tumor stamcellen afkomstig van verschillende muismodellen van medulloblastoom, met constitutief geactiveerde Shh weg als gevolg van een mutatie in gladgestreken (11, hierop aangeduid als SmoM2), een GPCR dat essentieel is voor Shh weg activering. In elke geïsoleerde medulloblastoom weefsel, waren we in staat om een groot aantal zeer proliferatieve kolonies vast te stellen. Deze cellen robuust uitgedrukt verschillende neurale stamcellen merkers zoals Nestin en Sox2, kunnen ondergaan seriële passages (groter dan 20) en werden Monogene. Hoewel deze gekweekte tumorcellen stamcellen waren relatief kleine, vaak bipoar met een hoge nucleair cytoplasma-ratio indien gekweekt onder omstandigheden gunste van stamcellen groei, zien zij dramatisch veranderd hun morfologie, uitgebreid met meerdere cellulaire processen, afgeplat en trok zich terug uit de celcyclus bij overschakelen naar een cel kweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum. Wat nog belangrijker is, deze tumor stamcellen gedifferentieerd in Tuj1 + of Neun + neuronen, GFAP + astrocyten en oligodendrocyten CNPase +, waardoor de nadruk leggend op multi-potentie. Bovendien zijn deze cellen in staat waren van teeltmateriaal secundaire medulloblastomen wanneer orthotopically getransplanteerd in muizen gastheer.
Protocol
1. Micro-dissectie van tumor-dragende kleine hersenen, Dissociatie van tumorweefsel en Plating
- Ophalen van tumorweefsel
- Zieke muizen met medulloblastoom waren vaak runted, weergegeven hydrocefalie en typische neurologische symptomen, waaronder posterior verlamming en gebrek aan houding terug te krijgen wanneer deze is gekanteld. Te halen tumorweefsel, euthanaseren muizen door kooldioxide inademing. Het is belangrijk om niet uit te voeren cervicale dislocatie, een procedure die druk genereert op de achterste schedel en in gevaar kunnen brengen tumorweefsel integriteit.
- Onthoofding wordt onmiddellijk uitgevoerd na de dood met behulp van een schaar, het verwijderen van haar-en spierweefsel zo veel mogelijk voor een goede visualisatie van de schedel. Reinig het oppervlak van de schedel met Kimwipe doordrenkt met 95% ethanol.
- Gebruik fijne schaar om een opening snijden langs de middellijn van de schedel, en de schedel weefsel met behulp van fijne pincet, op welk punt de gehele hersenen inclusief tumor-dragende cerebellum wordt blootgesteld te verwijderen.
- Terwijl de cerebella van gezonde volwassenen weer goed gedefinieerde halfrond en vermis, het cerebella van tumor-dragende muizen zijn vaak vergroot, amorfe met een glad oppervlak en opvallende bloedvaten. Met behulp van steriele technieken, halen de cerebellaire tumor met een pincet en plaats in ijskoud PBS zonder Mg 2 + en Ca 2 +.
Opmerking: alle instrumenten worden gesteriliseerd in 95% ethanol voor gebruik. - Dissociatie van tumorweefsel
- Breng de tumor weefsel van PBS tot 50% Accutase (verdund in PBS), dat is ongeveer 4 maal het volume van de tumor weefsel, gehakt het weefsel met fijne schaar gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door incubatie bij 37 ° C gedurende 4 minuten , waarna het weefsel ondergaat repetitieve pipetteren met een 1-mL Pipetman voor extra 3 minuten. Deze methode moet opleveren een mengsel van afzonderlijke cellen en kleine cellulaire aggregaten.
- Verwatering van de cellulaire suspensie 3-voudige met PBS en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1000 g om pellet de cellen. Resuspendeer de celpellet in verse neurale stamcellen kweekmedium en de plaat op een ontsloten 60 mm Primaria weefselkweek schotel. We maken gebruik van Primaria gerechten voor een betere hechting op het eerste beplating, de daaropvolgende passages kunnen worden uitgeplaat op regelmatige weefselkweek gerechten.
Let op: Coat cultuur gerechten met 0,1% gelatine voor ten minste 30 minuten. Bereid verse neurale stamcellen cultuur medium dat bestaat uit Neurobasal medium met glutamine, Pen-Strep, N2, B27, menselijke EGF (25 ng / ml) en basic FGF (25ng / ml).
2. Verrijking, onderhoud en uitbreiding van Medulloblastoom tumorcellen door Serial Passages
We meestal krijgen veel kolonies na 1 week van de eerste platen (figuur 1). Deze kolonies kunnen worden gescheiden en opnieuw uitgeplaat op nieuwe gelatinized gerechten voor verrijking van de tumorcel bevolking. Eerste wijziging in nieuwe cultuur medium, gebruik dan simpelweg een 1-mL Pipetman mechanisch los te kolonies gevolgd door repetitieve pipetteren gedurende 4 minuten tot een cellulaire suspensie (geen Accutase nodig) opleveren. Controleer onder een microscoop om ervoor te zorgen dat de grote cel klonten zijn los geweest. Dan afzien van celsuspensie op nieuwe gelatinized gerechten voor verder kweken en gaan via dezelfde procedure voor de overige passages. Losse tumorcellen, bloedcellen en andere celtypes worden verwijderd door serial re-gemetalliseerde delen, waardoor de bijgevoegde tumorcellen te snel uit te breiden. Verandering kweekmedium op de tweede dag na de eerste zaaien, en om de andere dag daarna.
3. Immunofluorescentie kleuring en Onderzoek van de gekweekte cellen
1. Grow tumorcellen op glas coverslips
Op dag 1, place een glas dekglaasje in elk van een 6-well plaat, voeg dan 0,1% gelatine gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Seed ongeveer 2-4X 10 5 tumorcellen per ml. De cellen moeten hechten 's nachts en de neurale stamcellen medium wijziging was op dag 3. Kleuring is uitgevoerd op dag 4.
2 Immunofluorescente vlekken
Twee keer te verwijderen kweekmedium en was cellen met ijskoud PBS. Fixeer de cellen met vers-en-klare 4% PFA gedurende 15 minuten. Tweemaal kort wassen cellen met PBS en permeablize met 0,3% Triton (in PBS) gedurende 5 minuten. Tweemaal kort wassen cellen met PBS en blok met 10% geit serum gedurende 40 minuten. Incubeer de cellen met primaire antilichaam voor 90 minuten, daarna wassen cellen drie keer met PBS, gedurende 5 minuten elk. Incubeer de cellen met secundaire antilichaam gedurende 60 minuten, daarna wassen drie keer met PBS, elk 5 minuten. Mount coverslips op dia's met 5 ml van een waterige medium montage en het uitvoeren van confocale microscopie.
4. Differentiatie van tumorcellen
Verwijder nEural stamcel middellange en korte tijd twee keer wassen met PBS-cellen. Voeg differentiatie medium op dag 1, te wijzigen medium op dag 4 en bepalen mate van differentiatie door immunofluorescentiekleuring op dag 7. De differentiatie medium bestaat uit DMEM, Pen-Strep en 10% foetaal runderserum.
5. Representatieve resultaten
Morfologie resultaten
Na de Accutase behandeling en zachte repetitieve pipetteren, moet de tumor weefsel meestal los gezien worden in kleine cellulaire aggregaten en enkele cellen. Veel omvangrijke kolonies kunnen worden waargenomen vanaf 5 dagen na de eerste plating, zoals blijkt uit figuur 1. Zeer proliferatieve tumorcellen zijn vaak bi-polair met een hoge nucleaire / cytoplasmatische ratio. Deze cellen worden gezien meestal stralen van kleine mobiele aggregaten aan de verstijfseld oppervlak. Bloedcellen, klein en rond, worden meestal verwijderd door latere media veranderingen en seriële gemetalliseerde delen. Na een aantal passages, kan men waarnemen gelijkmatig verdeeld, proliferatieve Ki67 + tumorcellen en weinig vervuiling met andere celtypes (figuur 2).
Expressie van neurale stamcellen markers, klonale analyse en differentiatie in meerdere lineages
Om te bepalen of de proliferatieve cellen, afkomstig van gescheiden cerebellaire tumor weefsel vertonen kenmerken van de tumor stamcellen, voerden we verdere karakterisering van stamcellen marker expressie, klonale analyse en differentiatie potentie. We vonden dat deze geïsoleerde tumorcellen zeer neurale stamcellen merkers zoals Sox2 en Nestin (figuur 3) te drukken. Zoals we weefsels van SmoM2-YFP tumor teruggehaald, alle tumorcellen te uiten YFP. In overeenstemming met een recente studie meldt dat primaire cilia zijn belangrijk voor de ontwikkeling van Shh pad-afhankelijke medulloblastoom 12, SmoM2-YFP expressie werd duidelijk gelokaliseerd in de cilia van Sox2 + tumorcellen (figuur 3). Bij het vergulde bij klonale dichtheid van 300 cellen per ml van de cultuur medium, zagen we klonale expansie van een enkele tumorcel om een omvangrijke kolonie (figuur 4). Bovendien zijn deze cellen waren in staat om te differentiëren in verschillende neuronale en gliale celtypes indien gekweekt onder pro-differentiatie omstandigheden (figuur 5).
Figuur 1. Morfologie van een zeer proliferatieve kolonie na de eerste beplating van gedissocieerd medulloblastoom weefsel. In het algemeen, is een omvangrijke kolonie vormen binnen 5 dagen na de eerste zaaien van gescheiden tumorweefsel, en een vertegenwoordiger een hier geïllustreerd in helder veld. Bi-polair, langwerpige cellen stralen uit een dichte kern cel aggregaat. Gehecht aan de tumorcellen zijn kleine, ronde rode bloedcellen, die langzaam uitgeput raken door de seriële gemetalliseerde delen.
Figuur 2. Morfologie van de gevestigde medulloblastoom cellen dan drie passages. Deze heldere veld beeld toont het typische uitzicht van de gevestigde medulloblastoom cellen na een aantal passages. De cellen blijven meestal bi-polair met een hoge nucleaire / cytoplasmatische ratio. We tonen geacetyleerd tubuline kleuring van tumorcellen, waarvan de meeste fiets zoals blijkt uit een sterke Ki67 expressie.
Figuur 3. Opgericht medulloblastoom cellen brengen neurale stamcellen markers. SmoM2-YFP merken cellen die constitutief actieve Smo, vandaar Shh pad activiteit. Alle cellen van de gevestigde medulloblastoom cellijnen uitgedrukt YFP, en de meeste co-expressie hoge niveaus van verschillende neurale stamcellen markers, zoals Nestin en Sox2. Interessant is dat wanneer we YFP signaal detectie uitgevoerd met een minimale laservermogen tijdens de confocale microscopie, we ontdekt geconcentreerd YFP signaal in de cilia van Sox2 + cellen. Deze waarneming is in overeenstemming met een recent rapport 12, dat de essentiële rol van cilia beschreven in de ontwikkeling van Shh pad-afhankelijke medulloblastoom.
Figuur 4. Opgericht tumorcellen ondergaan klonale expansie. Na dissociatie in enkele celsuspensie werden tumorcellen uitgeplaat op een 24 goed-plaat op een klonale dichtheid van 300 cellen per ml kweekmedium. In elk putje zagen wij klonaal uitgebreid kolonies. Deze serie van heldere veld beelden te tonen typische veranderingen over een periode van 10 dagen van de cultuur.
Figuur 5. Differentiatie analyses van de gevestigde medulloblastoom cellen. Wanneer tumorcellen werden overgeschakeld van het EFG / bFGF met serum-vrij medium tot DMEM/10% FBS, YFP + tumorcellen significant veranderd hun morfologie en onderscheiden in verschillende celtypes, incLuding Tuj1 + of Neun + neuronen, GFAP + astroglial cellen of CNPase + oligodendrocyten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven een efficiënte manier te isoleren, te verrijken en te onderhouden medulloblastoom stamcellen uit de primaire tumor weefsel opgehaald uit mutante muizen met een constitutief actieve Hedgehog signalering. Wij vonden dat een belangrijke stap in de succesvolle oprichting van een gezonde tumor stamcel lijn is de Accutase behandeling gebruikt tijdens de dissociatie van de primaire tumor weefsel. In onze ervaring, bij de eerste distantiëren tumorweefsel van het cerebellum, 4 minuten 50% Accutase behandeling bij 37 ° C, gevolgd door 3 minuten van repetitieve pipetteren met een 1-mL Pipetman zal over het algemeen leiden tot een succesvolle eerste zaaien. Het is ook belangrijk om te wachten tot omvangrijke kolonies worden gevormd voordat ze opnieuw-plating (figuur 1). Na de eerste zaaien, Accutase behandeling niet meer nodig is, repetitieve pipetteren in 3-4 minuten met behulp van een 1-mL Pipetman is voldoende te verjagen en de cel klonten dissociëren voor re-plating. Gebruik geen kleinere volume Pipetman als de fijnere tips zal uitgebreid beschadiging van de cellen. Een gevestigde cellijn kan worden gegenereerd op basis van elkaar zijn gescheiden tumorweefsel en deze cellen zijn zeer proliferatieve, robuust uitdrukkelijke verschillende neurale stamcellen markers en kunnen differentiëren in zowel neuronale en gliale celtypes. Wij hebben orthotope transplantatie van deze cellen in de immuno-gecompromitteerde ontvangende muizen die vervolgens ontwikkeld secundaire medulloblastomen. Deze tumorcellen in cultuur zelden tentoongesteld spontane differentiatie of apoptose, kenmerken die gemeenschappelijk zijn voor neurosphere cultuur methoden. Dit protocol is ontworpen voor de succesvolle verspreiding van tumorcellen stamcellen afgeleid van de primaire medulloblastomen en dus, zal ons in staat om de effecten van kandidaat-genen en chemische inhibitoren testen op Hedgehog-driven tumorcelgroei en gedrag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Vanderbilt-Ingram Cancer Center Support Grant (P30 CA068485), de Childhood Brain Tumor Foundation en het National Institutes of Health (NS042205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | 0.1% |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM |
| Primaria dishes | Fisher Scientific | 087724C | |
| Sox2 antibody | EMD Millipore | MAB4343 | Mouse, 1:1000 |
| Nestin antibody | DSHB | rat401 | Mouse, 1:200 |
| YFP antibody | Molecular Probes, Life Technologies | A11122 | Rabbit, 1:2000 |
| GFAP antibody | Neuromics | CH22102 | Chicken, 1:1000 |
| Tuj1 antibody | Sigma-Aldrich | T5076 | Mouse, 1:2000 |
| NeuN antibody | EMD Millipore | MAB377 | Mouse, 1:2000 |
| CNPase antibody | EMD Millipore | MAB326 | Mouse, 1:1000 |
References
- Rossi, A., Caracciolo, V., Russo, G. Medulloblastoma: From Molecular Pathology to Therapy. Clin Cancer Res. 14 (4), 971-971 (2008).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. Control of Neuronal Precursor Proliferation in the Cerebellum by Sonic Hedgehog. P. Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).
- Dahmane, N., Ruiz, A., Altaba, I. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3089 (1999).
- Wallace, V. A. Purkinje-cell-derived Sonic hedgehog regulates granule neuron precursor cell proliferation in the developing mouse cerebellum. Curr Biol. 9 (8), 445-445 (1999).
- Fan, X., Eberhart, C. G. Medullablastoma Stem Cells. J Clin Oncol. 26 (17), 2821-2821 (2008).
- Yoon, J. W., Gilbertson, R., Iannaccone, S. Defining a Role for Hedgehog Pathway Activation in Desmoplastic Medulloblastoma by Identifying GLI1 Target Genes. International journal of cancer. 124 (1), 109-109 (2009).
- O'Dorisio, M. S., Khanna, G., Bushnell, D. Combining anatomic and molecularly targeted imaging in the diagnosis and surveillance of embryonal tumors of the nervous and endocrine systems in children. Review. Cancer metastasis reviews. 27 (4), 665-665 (2008).
- Corcoran, R. B., Bachar Raveh, T., Barakat, M. T. Insulin-like Growth Factor 2 Is Required for Progression to Advanced Medulloblastoma in patched1 Heterozygous Mice. Cancer research. 68 (21), 8788-8788 (2008).
- Gilbertson, R. J., Ellison, D. W. The Origins of Medulloblastoma Subtypes. Annual review of pathology. 3, 341-341 (2008).
- Ward, R. J., Lee, L., Graham, K. Multipotent CD15+ Cancer Stem Cells in Patched-1 Deficient Mouse Medulloblastoma. Cancer research. 69 (11), 4682-4682 (2009).
- Mao, J., Ligon, K. L., Rakhlin, E. Y. A Novel Somatic Mouse Model to Survey Tumorigenic Potential Applied to the Hedgehog Pathway. Cancer research. 66, 10171-10171 (2006).
- Han, Y. G., Kim, H. J., Dlugosz, A. A. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature medicine. 15 (9), 1062-1062 (2009).
