Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung, Anreicherung und Pflege von Medulloblastom Tumorstammzellen von mutierten Mäusen mit ektopischen Sonic Hedgehog-Signalweg Tätigkeit stammen.
Abstract
Hirntumore sind vorgeschlagen worden, um eine kleine Population von Stammzellen, die die Ursache der Tumorentstehung sind, besitzen. Neurosphäre Assays wurden in der Regel angenommen, um die Natur der neuralen Stammzellen, einschließlich derjenigen von normalem und Tumorgewebe gewonnen zu studieren. Allerdings sind erhebliche Mengen an Differenzierung und Zelltod in kultivierten Neurosphären wahrscheinlich auf sub-optimalen Zustand wie Zugänglichkeit aller Zellen innerhalb Sphäre Aggregate Kulturmedium verbreitet.
Medulloblastom, der häufigste pädiatrische ZNS-Tumor, zeichnet sich durch seine schnelle Progression und die Tendenz, über die gesamte Gehirn-Rückenmark-Achse mit düsteren klinische Ergebnis Verbreitung aus. Medulloblastom ist ein neuro-Tumor des Kleinhirns, rund 20% und 40% der intrakraniellen und hinteren Schädelgrube Tumor in der Kindheit, bzw. 1. Es ist inzwischen gut etabliert, dass Shh Signal Verbreitung von Kleinhirn Granulat Neuron Vorstufen (CGNPs) stimuliert während des Kleinhirns Entwicklung 2-4. Zahlreiche Studien mit Maus-Modellen, in denen die Shh Weg konstitutiv aktiviert ist, haben Shh Signalisierung mit Medulloblastom 5-9 verbunden.
Ein kürzlich veröffentlichter Bericht hat gezeigt, dass eine Untergruppe von Medulloblastom Zellen aus Patched1 LacZ / + Mäusen abgeleitet Krebsstammzellen, die in der Lage die Initiierung und propogating Tumoren 10 sind sind. Hier beschreiben wir eine effiziente Methode zu isolieren, zu bereichern und zu pflegen Tumorstammzellen aus mehreren Mausmodellen Medulloblastom abgeleitet, mit konstitutiv aktivierten Shh-Weg durch eine Mutation in Smoothened (11, Darüber entstand genannt SmoM2), ein GPCR, die kritisch für Shh ist Stoffwechselwegaktivierung. In jedem isolierten Medulloblastom Gewebe, konnten wir zahlreiche hoch proliferative Kolonien zu gründen. Diese Zellen robust äußerten mehrere neuronalen Stammzell-Marker wie Nestin und Sox2 erfahren können, serielle Passagen (größer als 20) und wurden klonogenen. Während diese kultivierten Tumor-Stammzellen waren relativ klein, oft bipoar mit hohen nuklearen auf Plasma-Relation, wenn unter Bedingungen, die Stammzellen zur Vermehrung kultiviert, sie dramatisch verändert ihre Morphologie, erweiterte mehrere zelluläre Prozesse, abgeflacht und zog sich aus dem Zellzyklus beim Umschalten auf eine Zelle Kulturmedium mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt. Noch wichtiger ist, diese Tumorstammzellen in Tuj1 differenzierte + oder NeuN + Neuronen, Astrozyten GFAP + und + CNPase Oligodendrozyten, damit sie deren Multi-Potenz. Außerdem wurden diese Zellen in der Lage zu verbreiten sekundären Medulloblastome bei orthotop in Host-Mäuse transplantiert.
Protocol
1. Micro-Dissektion der tumortragenden Cerebellum, Dissoziation von Tumorgewebe und Plating
- Retrieval von Tumorgewebe
- Kranke Mäuse mit Medulloblastom oft runted, angezeigt Hydrocephalus und typische neurologische Symptome, einschließlich posterior Lähmung und Unfähigkeit zur Haltung wieder, wenn umgeworfen. Zum Abrufen von Tumorgewebe, euthanize Mäusen durch Kohlendioxid Einatmen. Es ist wichtig, nicht zu Genickbruch, eine Prozedur, die Druck erzeugt, um den hinteren Schädel und kann Tumorgewebe Integrität Kompromiss führen.
- Enthauptung ist unmittelbar nach dem Tod mit einer Schere durchgeführt, das Entfernen von Haaren und Muskelgewebe so viel wie möglich für eine gute Visualisierung des Schädels. Reinigen Sie die Oberfläche des Schädels mit Kimwipe mit 95% Ethanol getränkt.
- Verwenden einer feinen Schere, um eine Öffnung entlang der Mittellinie des Schädels geschnitten, und entfernen Schädel Gewebe mit feinen Pinzette, an welcher Stelle das ganze Gehirn einschließlich tumortragenden Kleinhirn ausgesetzt ist.
- Während die cerebella von gesunden Erwachsenen gut definierten Hemisphären und Vermis-Display, sind die cerebella von Tumor-tragenden Mäusen oft vergrößert, amorph mit einer glatten Oberfläche und auffällige Blutgefäße. Mit sterilen Techniken, rufen Sie die Kleinhirntumor mit einer Pinzette und in eiskaltem PBS ohne Mg 2 + und Ca 2 +.
- Die Dissoziation von Tumorgewebe
- Übertragen Sie die Tumorgewebe von PBS zu 50% Accutase (verdünnt in PBS), die etwa 4-mal das Volumen des Tumorgewebes ist, Hackfleisch das Gewebe mit einer feinen Schere für 3 Minuten bei Raumtemperatur, durch Inkubation bei 37 ° C für 4 Minuten , nach denen das Gewebe erfährt repetitive Pipettieren mit einer 1-mL Pipetman für weitere 3 Minuten. Diese Methode sollte Ausbeute eine Mischung aus Einzelzellen und kleine zelluläre Aggregate.
- Verdünnen Sie die Zellsuspension 3-fach mit PBS und zentrifugieren Sie für 5 Minuten bei 1000 g zur Pelletierung der Zellen. Zellpellet in frischem neuralen Stammzellen Zellkulturmedium und Teller auf einem verkleistert 60 mm Primaria Gewebekulturschale. Wir verwenden Primaria Gerichte für eine verstärkte Bindung auf den ersten Beschichtung; anschließenden Passagen können auf regelmäßige Gewebekulturschalen beschichtet werden.
Hinweis: Alle Instrumente sind in 95% igem Ethanol vor Gebrauch sterilisiert.
Hinweis: Coat Kulturschalen mit 0,1% Gelatine für mindestens 30 Minuten. Bereiten Sie frische neuralen Stammzellen Kulturmedium bestehend aus Neurobasal Medium mit Glutamin, Pen-Strep, N2, B27, menschlichen EGF (25 ng / mL) und basic FGF (25ng / mL).
2. Enrichment, Wartung und Ausbau des Medulloblastom Tumorzellen durch serielle Passagen
Wir in der Regel bekommen viele Kolonien nach 1 Woche der erste Beschichtung (Abbildung 1). Diese Kolonien getrennt werden kann und replattiert auf neue verkleistert Gerichte für die Anreicherung des Tumors Zellpopulation. Erster Wechsel auf neue Kulturmedium, dann verwenden Sie einfach ein 1-mL Pipetman mechanisch lösen Kolonien durch repetitive Pipettieren für 4 Minuten, um eine Zellsuspension (keine Accutase erforderlich) ergeben. Überprüfen Sie unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass große Zellklumpen wurden dissoziiert. Dann verzichten Zellsuspension auf neue verkleistert Gerichte für die weitere Züchtung und gehen durch das gleiche Verfahren für weitere Passagen. Unattached Tumorzellen, Blutkörperchen und anderen Zelltypen werden durch serielle re-Beschichtungen entfernt, wobei die beigefügte Tumorzellen rasch expandieren. Ändern Kulturmedium am zweiten Tag nach der ersten Aussaat, und jeden zweiten Tag danach.
3. Immunfluoreszenzfärbung und Prüfung von kultivierten Zellen
1. Wachsen Tumorzellen auf Deckgläschen
Am Tag 1, stellen Sie einen Deckglas in jeder der 6-Well-Platte, dann fügen Sie 0,1% Gelatine für 30 Minuten bei 37 ° C. Seed ca. 2-4x 10 5 Tumorzellen pro Milliliter. Die Zellen sollten legen über Nacht und die neuralen Stammzellen Medium am Tag 3 geändert. Die Färbung ist am Tag 4 durchgeführt.
2 Immunfluoreszenzfärbung
Entfernen Kulturmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS. Fix die Zellen mit frisch zubereiteten 4% PFA für 15 Minuten. Kurz waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und permeablize mit 0,3% Triton (in PBS) für 5 Minuten. Kurz waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und Block mit 10% Ziegenserum für 40 Minuten. Inkubieren Sie die Zellen mit dem primären Antikörper für 90 Minuten, dann waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten. Inkubieren Sie die Zellen mit sekundären Antikörper für 60 Minuten, dann dreimal mit PBS, jeweils 5 Minuten. Berg Deckgläser auf Objektträger mit 5 ml einer wässrigen Eindeckmedium und führen konfokalen Mikroskopie.
4. Die Differenzierung von Tumorzellen
Entfernen neuralen Stammzellen mittel-und kurz waschen Sie die Zellen mit PBS zweimal. Add Differenzierungsmedium am Tag 1, ändern Medium an Tag 4 und bestimmen Niveau der Differenzierung durch Immunfluoreszenzfärbung am Tag 7. Die Unterscheidung Medium besteht aus DMEM, Pen-Strep und 10% fötalem Rinderserum.
5. Repräsentative Ergebnisse
Morphologie Ergebnisse
Nach Accutase Behandlung und sanfte repetitive Pipettieren, sollte das Tumorgewebe werden meist dissoziiert in kleine zelluläre Aggregate und einzelne Zellen. Viele ansehnliche Kolonien können so früh wie 5 Tage nach der ersten Beschichtung beobachtet werden, wie in Abbildung 1 dargestellt. Hohe proliferative Tumorzellen sind oft bi-polar mit hohen nuklearen / Plasma-Relation. Diese Zellen sind zu sehen in der Regel strahlenförmig von kleinen zellulären Aggregaten an der Oberfläche verkleistert. Blutzellen, klein und rund, sind in der Regel durch nachfolgende Medien Veränderungen und serielle Beschichtungen entfernt. Nach mehreren Passagen kann man beobachten, gleichmäßig verteilt, proliferative Ki67 + Tumorzellen und wenig Kontamination mit anderen Zelltypen (Abb. 2).
Expression von neuronalen Stammzell-Marker, klonale Analyse und Differenzierung in mehrere Linien
Um festzustellen, ob die proliferative Zellen aus dissoziierten Kleinhirn Tumorgewebe zeigen Eigenschaften von Tumorstammzellen abgeleitet, führten wir eine weitere Charakterisierung von Stammzellen Marker Ausdruck, klonale Analyse und Differenzierung Potenz. Wir fanden, dass diese isolierten Tumorzellen stark zum Ausdruck neuronalen Stammzell-Marker wie Sox2 und Nestin (Abbildung 3). Wie wir Gewebe aus SmoM2-YFP Tumor abgerufen, alle Tumorzellen exprimieren YFP. Im Einklang mit einer aktuellen Studie berichtet, dass primäre Zilien sind für die Entwicklung von Shh Weg-abhängige Medulloblastom 12, SmoM2-YFP-Expression wurde eindeutig auf die Cilien von Sox2 + Tumorzellen (Abbildung 3) lokalisiert wichtig. Wenn bei klonaler Dichte von 300 Zellen pro ml Kultur-Medium, beobachteten wir klonale Expansion von einer einzigen Tumorzelle zu einem beträchtlichen Kolonie (Abbildung 4). Darüber hinaus wurden diese Zellen in der Lage, in verschiedenen neuronalen und glialen Zelltypen zu differenzieren, wenn sie unter pro-Differenzierung Bedingungen (Abbildung 5) kultiviert.
Abbildung 1. Morphologie eines hoch proliferative Kolonie nach der ersten Beschichtung von dissoziierten Medulloblastom Gewebe. Im Allgemeinen ist eine ansehnliche Kolonie bildet innerhalb von 5 Tagen nach der ersten Aussaat von dissoziierten Tumorgewebe, sowie ein Vertreter hier in Hellfeld dargestellt. Bi-polar, länglichen Zellen strahlen aus einem dichten Kern Zellverbandes. An der Tumorzellen sind klein, rund roten Blutkörperchen, die sich allmählich über die serielle Beschichtungen sind erschöpft.
Abbildung 2. Morphologie der etablierten Medulloblastom Zellen über drei Passagen. Das Hellfeld-Bild zeigt das typische Erscheinungsbild von etablierten Medulloblastom-Zellen nach mehreren Durchgängen. Die Zellen bleiben meist bi-polar mit hohen nuklearen / Plasma-Relation. Wir zeigen acetylierten Tubulin-Färbung von Tumorzellen, von denen die meisten das Fahrrad als durch starke Ki67 Expression gezeigt.
Abbildung 3. Gegründet Medulloblastom-Zellen exprimieren neuronalen Stammzell-Marker. SmoM2-YFP markiert Zellen, die konstitutiv aktive Smo, damit Shh Weg Aktivität. Alle Zellen der etablierten Medulloblastom-Zelllinien exprimiert YFP, und die meisten von ihnen koexprimiert ein hohes Maß an verschiedenen neuronalen Stammzell-Marker, wie zB Nestin und Sox2. Interessanterweise, wenn wir YFP Signalerkennung erfolgt mit minimaler Laserleistung während der konfokalen Mikroskopie entdeckten wir konzentriert YFP-Signal in den Cilien von Sox2 + Zellen. Diese Beobachtung steht im Einklang mit einem kürzlich veröffentlichten Bericht 12, der die wesentliche Rolle der Flimmerhärchen in der Entwicklung von Shh Weg-abhängige Medulloblastom beschrieben.
Abbildung 4. Gegründet Tumorzellen zum klonalen Expansion. Nach Dissoziation in Einzel Zellsuspension wurden Tumorzellen auf eine 24-Well-Platte bei einer klonalen Dichte von 300 Zellen pro ml Kultur-Medium. In jede Vertiefung beobachteten wir klonal expandierten Kolonien. Diese Serie von Hellfeld Bilder zeigen typische Veränderungen im Laufe einer 10-tägigen Zeitraum von Kultur.
Abbildung 5. Differenzierung Analysen der etablierten Medulloblastom-Zellen. Wenn Tumorzellen von EGF / bFGF mit serum-freiem Medium zu DMEM/10% FBS, YFP wurden eingeschaltet + Tumorzellen wesentlich verändert ihre morphology und differenziert in verschiedene Zelltypen, einschließlich Tuj1 + oder NeuN + Neuronen, GFAP + Astrozyten oder Oligodendrozyten CNPase +.
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Discussion
Wir beschreiben eine effiziente Möglichkeit zu isolieren, zu bereichern und zu pflegen Medulloblastom Stammzellen aus primärem Tumorgewebe von mutierten Mäusen mit konstitutiv aktiven Hedgehog Signalisierung abgerufen. Wir fanden, dass ein kritischer Schritt in der erfolgreichen Etablierung einer gesunden Tumor Stammzell-Linie der Accutase Behandlung während der Dissoziation des primären Tumorgewebe verwendet wird. Nach unserer Erfahrung beim ersten distanziert Tumorgewebe aus dem Kleinhirn, 4 Minuten von 50% Accutase Behandlung bei 37 ° C, gefolgt von 3 Minuten von sich wiederholenden Pipettieren mit einer 1-mL Pipetman wird in der Regel in erfolgreichen ersten Aussaat führen. Es ist auch wichtig zu warten, bis ansehnliche Kolonien vor re-Plating (Abbildung 1) gebildet werden. Nach der ersten Aussaat, ist Accutase Behandlung nicht mehr notwendig; repetitive Pipettieren für 3-4 Minuten mit einem 1-mL Pipetman ist ausreichend, um zu verdrängen und distanzieren Zellklumpen für re-Beschichtung. Verwenden Sie keine kleineren Volumen Pipetman als die feineren Spitzen werden die Zellen umfassend Schäden. Eine etablierte Zelllinie, die aus jedem Tumorgewebe isolierten erzeugt werden kann und diese Zellen sind hoch proliferative, robust auszudrücken mehreren neuronalen Stammzell-Marker und kann sowohl in neuronalen und glialen Zelltypen zu differenzieren. Wir haben orthotopen Transplantation dieser Zellen in immungeschwächten Empfängermäuse die später entwickelten sekundären Medulloblastome durchgeführt. Diese Tumorzellen in Kultur nur selten ausgestellt spontane Differenzierung oder Apoptose, Funktionen, die auf Neurosphäre Kultur Methoden sind. Dieses Protokoll ist für die erfolgreiche Vermehrung von Tumor-Stammzellen, die aus primären Medulloblastom abgeleitet ausgelegt und somit wird es uns ermöglichen, die Auswirkungen von Kandidatengenen und chemische Inhibitoren auf Hedgehog-driven das Wachstum von Tumorzellen und das Verhalten zu testen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch Zuschüsse der Vanderbilt-Ingram Cancer Center Support Grant (P30 CA068485), der Hirntumor bei Kindern Foundation und den National Institutes of Health (NS042205) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | 0.1% |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM |
| Primaria dishes | Fisher Scientific | 087724C | |
| Sox2 antibody | EMD Millipore | MAB4343 | Mouse, 1:1000 |
| Nestin antibody | DSHB | rat401 | Mouse, 1:200 |
| YFP antibody | Molecular Probes, Life Technologies | A11122 | Rabbit, 1:2000 |
| GFAP antibody | Neuromics | CH22102 | Chicken, 1:1000 |
| Tuj1 antibody | Sigma-Aldrich | T5076 | Mouse, 1:2000 |
| NeuN antibody | EMD Millipore | MAB377 | Mouse, 1:2000 |
| CNPase antibody | EMD Millipore | MAB326 | Mouse, 1:1000 |
References
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