Summary
עבור פיתוח של התערבות RNA (RNAi) טיפולים מבוססי, אסטרטגיה רומן פותחה, transkingdom RNAi (tkRNAi). טכנולוגיה זו משתמשת פתוגניים שאינם חיידקים כדי לייצר ולספק טיפולית מכבנה RNA קצר (shRNA) לתאי המטרה. כאן, tkRNAi יושמה בהצלחה היפוך ההתנגדות ABCB1 בתיווך קלאסית multidrug (MDR) של תאים סרטניים.
Abstract
התערבות RNA (RNAi) מהווה מנגנון אפקטיבי גבוה עיכוב מסוים של ביטוי ה-mRNA. מלבד הפוטנציאל שלו ככלי מעבדה עוצמה, מסלול RNAi נראה מבטיח ניצול טיפולית. עבור פיתוח של התערבות RNA (RNAi) טיפולים מבוססי, המסירה של RNAi-בתיווך סוכני לתאי המטרה היא אחד המכשולים העיקריים. אסטרטגיה הרומן להתגבר על המשוכה הזאת הוא transkingdom RNAi (TK RNAi). טכנולוגיה זו משתמשת פתוגניים שאינם חיידקים, למשל Escherichia coli, לייצר ולספק טיפולית מכבנה RNA קצר (shRNA) לתאי מטרה לגרום RNAi. הדור הראשון TK-RNAi מתווך, טיול וקטור, מכיל את מקדם T7 bacteriophage להסדרת ביטוי shRNA טיפולית של עניין. יתר על כן, תשמ"ה אינו מוקד Inv מ pseudotuberculosis Yersinia המקודד invasin, המאפשר לחיידקים פולשנית טבעי להיכנס β1-integrin חיוביים בתאי יונקים ואת הגן HlyA מ חיידקי ליסטריה, אשר מייצרת listeriolysin O. אנזים זה מאפשר shRNA טיפולית לברוח כניסה שלפוחית בתוך הציטופלסמה של תא המטרה. בונה תשמ"ה מוכנסים זן המוסמכת Escherichia coli שאינם פתוגניים, אשר מקודד T7 RNA פולימראז הכרחי לסינתזה T7 האמרגן מונחה של shRNAs. היטב מאופיין סרטן הקשורים מולקולה יעד שונים אסטרטגיות RNAi הוא ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). זה טרנספורטר-ABC משמש משאבה תרופה שחול ומתווך "קלאסיים" ABCB1 בתיווך multidrug ההתנגדות (MDR) הפנוטיפ של תאים סרטניים אנושיים אשר מאופיינת דפוס לחצות התנגדות ספציפית. ABCB1-לבטא בתאי סרטן שונים MDR טופלו אנטי ABCB1 וקטור shRNA ביטוי נושאות E. coli. הליך זה הביא הפעלת המסלולים RNAi בתוך התאים הסרטניים תקנה מטה ניכר של mRNA ABCB1 את הקידוד כמו גם את המשאבה המתאימה שחול סמים. בהתאם לכך, הצטברות התרופה היה משופר של עמידות לתרופות בתאים סרטניים וטהור לבין פנוטיפ MDR התהפכה. באמצעות מודל זה הנתונים מספקים הוכחה של קונספט זה TK RNAi מתאים אפנון של סרטן הקשורים גורמים, כגון ABCB1, בתאי סרטן אנושיים.
Protocol
1) משלוח חיידקית של shRNAs
- לפני שמתחילים עם התרבות חיידקים, יש להכין LB-בינוני LB-אגר.
- עבור LB-בינוני לשקול את תמצית שמרים (0.5% w / v), bacto tryptone (1.0% w / v), ואת NaCl (0.6% w / v) לדלל ברכיבים אלה אקווה bidest. הפתרונות צריכים להיות מוכנים לעקר ב החיטוי והם אז מוכן לשימוש.
- עבור LB-צלחות אגר אגר bacto (1.5% w / v) יש להוסיף עד בינוני LB הקודם עיקור.
- מחממים LB-אגר במיקרוגל עד LB-אגר הוא נמס לגמרי. בואו הפתרון להתקרר עד שהבקבוק יכול להיות נגע בקלות מבלי להישרף. הוסף kanamycin (100 מ"ג / מ"ל) עבור הבחירה של שיבוטים חיובי צעדים נוספים.
- הכן LB-אגר צלחות על ספסל זרימה למינרית (בתנאים סטריליים) על ידי pipetting 20 מ"ל של תמיסת LB-אגר לתוך 10 ס"מ פטרי, הכלים. בואו הצלחות להתקרר עד הנוזל הפך מוצק. הצלחות מוכנים כעת לשימוש יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס.
- ShRNA קידוד וקטורי ביטוי הופכים E. המוסמכת coli ceq221 ידי הלם חום באמצעות ההליך CaCl 2.
- פלייט את החיידקים שינו על צלחות LB-אגר המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin, לסגור את המכסה, לאטום את צלחות עם parafilm ולטפח במהופך על 37 ° C במשך הלילה.
- לחסן תרבויות מיני חיידקים עם שיבוטים חיובית על ידי הרמת מושבות גדלו עם לבחור השן. העברת השן לאסוף לתוך 7.0 מ"ל של מדיום LB-טריים המכילה 100 מ"ג / מ"ל kanamycin ולטפח ב 37 ° C במשך הלילה על שייקר בסל"ד 200.
- לחסן 100 מ"ל של LB טרי בינוני המכיל 100 מ"ג / מ"ל kanamycin 1:100 עם תרבות הלילה מעל מיני בקבוקון 1 אני Erlenmeyer ו לדגור על 37 ° C במשך הלילה על שייקר בסל"ד 200.
- Seed 25 x 10 4 (מספר התאים זורעים תלוי במהירות של צמיחת תאים של הקו הסלולרי בהתאם; confluency צריך להיות 70-80% ~ 24 שעות לאחר זריעה) אנושי לתאי סרטן קיבה (EPG85-257RDB) לכל היטב 6 - מנות היטב דגירה אלה ב 37 ° C, באווירה של 5% CO 2, אדי מים רוויים במשך הלילה.
- הקודם לזיהום תאים סרטניים, על תרבויות לילה של TK RNAi וקטור המכיל E. coli נמדדים פוטומטר כדי לקבוע את OD 600. לדלל את הפתרון חיידקי עד צפיפות אופטית של 0.5 הוא הגיע (OD 600 = 0.5 שווה 1.6 x 10 8 תאים חיידקיים / ml).
- החלף את FCS המכיל תרבית תאים בינוניים קרצינומה של תאים נגד בינוני FCS ללא 30 דקות הקודמים חיידקי שיתוף הדגירה.
- לשטוף חיידקים פעמיים עם 1 x PBS, וכן לדלל בסרום ללא בינוני ליבוביץ L-15.
- הוספת חיידקים בדילול לתאי הסרטן הרצוי משרד הפנים (ריבוי זיהום = מספר תאים חיידקיים לכל תא סרטני) ושיתוף דגירה חיידקים תאים סרטניים עבור 2 שעות 37 ° C.
- לאחר 2 שעות של שיתוף הדגירה תאים סרטניים נשטפו פעמיים עם 1x x PBS ופעם עם סרום המכיל בינוני ליבוביץ L-15 בתוספת 100 u / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם / מ"ל amphotericin, 150 מיקרוגרם / גנטמיצין מ"ל, ו -100 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin.
- המשך טיפוח תאים סרטניים ב 37 ° C, באווירה של 5% CO 2, אדי מים רוויים.
- ההשפעות של הטיפול חיידקים ניתן דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, נמדדת כמותית בזמן אמת RT-PCR על רמת ה-mRNA, ועל ידי ניתוח כתם המערבי על רמת חלבון, מוצג עם מבחני פונקציונלי כמו ניתוח FACS, ושגשוגם מבחני התא. (אם רוצים, הליכים אלה יכול להיות מתואר בפירוט).
2) נציג תוצאות
אם פרוטוקול מבוצעת כראוי, התוצאה הייתה צריכה להיות דומה לאלה המוצגות להלן.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי
איור 1 מציג תא אנושי קרצינומה של הקיבה שלוש שעות לאחר הטיפול חיידקים (א) בהשוואה תא מטופל (ב). מסביב לגרעין התא טיפול, החיידקים יכולים להתגלות.
איור 1: מיקרוסקופ פלורסנט האדם קיבה קרצינומה של תאים לאחר טיפול חיידקי (1:500) וגם תא מטופל אנושי קרצינומה של הקיבה כמו שליטה, DAPI-מכתים, DAPI bandpass מסנן (Λem = 640 ננומטר), מטרת 40X.
כמותי בזמן אמת RT-PCR
באיור 2 תקנה את ה-mRNA של MDR1 של כ -70% (קרן שחור) ניתן לראות לאחר טיפול עם חיידקים טיפולית. תאים הורים לשמש כביקורת חיובית בשל חוסר overexpression MDR1. השורה תא 257RDB p170 המכיל פלסמיד המבטא אנטי MDR1 shRNAs s נלקח השוואה ישירה של הטכנולוגיה transkingdom RNAi למחקר אחריםנאי השתקה אסטרטגיות. הקו מטופל תא עמיד EPG85-257RDB overexpressing MDR1, קו התא אותו שטופלו חיידקים חסר shRNA להביע פלסמיד, וזה קו תאים שטופלו חיידקים טיפולית נושא פלסמיד המבטא אנטי MRP2 shRNAs נלקחו כפקדי חיובית.
איור 2: כמותי בזמן אמת RT-PCR ביטוי MDR1 mRNA לאחר טיפול ה טיפולית coli ceq221 להביע אנטי MDR1 shRNAs (משרד הפנים 1: 500). נורמליזציה בוצעה באמצעות aldolase גן משק הבית. היחס MDR1/aldolase של תאים שלא טופלו של הקו הסלולרי EPG85-257RDB נקבעו 100%. P-ערכים חושבו באמצעות התלמיד מבחן t (= * p <0.05, ** = p <0.005, *** = p <0.001).
ניתוח כתם המערבי
איור 3 מגלה כי MDR1 למטה תקנה גם התקיים ברמת חלבון לאחר הטיפול חיידקים. הוא מציג את MDR1 חסר הבעה של שורת תאים רגישים סמים הורים (EPG85-257P), הביטוי MDR1 של קו תא מטופל עמידים תרופה (EPG85-257RDB) ואת הביטוי MDR1 המדגם טופלו. תקנה מטה ברורה של MDR1 של תאים שטופלו bacterially ניתן לצפות. 
איור 3: ניתוח כתם המערבי MDR1 רמות הביטוי של מטופל לתרופה רגיש EPG85-257P, מטופל עמידים לתרופות-EPG 257RDB, ושל EPG85-257RDB לאחר דגירה משותפת עם א. coli ceq221 + P43 MDR1. ראשי Ab C219 1:100, אנטי אקטין 01:05 000, משני Ab נגד עכבר 01:10 000.
Cytotoxicity assay
אנליזה פונקציונלית כמו assay cytotoxicity שמוצג באיור 4 הם גם אינדיקטורים לתפקוד של RNAi transkingdom. השורה תא ההורים קו התא המכיל אנית-MDR1 shRNA להביע פלסמיד לא מראים שום התנגדות daunorubicin. השורה תא עמיד EPG85-257RDB ושני שולטת עוד לא מראים שינויים משמעותיים התנגדות לעומת המדגם שטופלו נגד חיידקים MDR1 shRNA מביע בו התנגדות Daunorubicin יכול להיות הפוך על ידי כ -90%.
איור 4: assay cytotoxicity. תרופות ספציפיות IC50 ערכי נקבע על ידי assay cytotoxicity להישרדות התא. P-ערכים חושבו באמצעות התלמיד מבחן t (= * p <0.05, ** = p <0.005, *** = p <0.001).
Anthracycline assay הצטברות
על פי ההתנגדות הוריד דוגמאות ליחס bacterially (איור 4), הצטברות anthracycline של אנטי MDR1 תאים שטופלו shRNA הוא גדל על ידי כ -90% כפי שמוצג באיור 5. השורה תא ההורים את קו תא 257RDB p170 מראים הצטברות daunorubicin חזק עד 100%. וריאנט עמיד מראה נדיר כל הצטברות. תאים שטופלו נגד חיידקים MDR1 shRNA להביע מצביעים על עלייה הצטברות anthracyline של 90%.
איור 5: assay anthracycline הצטברות. Anthracycline הצטברות של תאים קרצינומה של 6 ימים לאחר הטיפול חיידקים נמדדת cytometry הזרימה. P-ערכים חושבו באמצעות התלמיד מבחן t (= * p <0.05, ** = p <0.005, *** = p <0.001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מספר תא זרע עבור זיהום הפנים המקביל בשימוש, ביקורתי תלוי שורות תאים תחת תצפית מהירותם של צמיחה. כדי למצוא מספרים תא האופטימלי עבור זריעה, טרום ניסויים כדי לקבוע את המהירות של הצמיחה מומלץ מאוד. מלבד זאת, MOIs שונים יש לבדוק בשל מוגבלת להאריך אשר התאים יכול לסבול את הפלישה חיידקי בלי למות של מתח. נקודת הזמן האופטימלי שבו תקנה את הגן תחת השגחה עשוי להשתנות. מומלץ לבצע ניסויים על פני תקופה מסוימת של זמן כדי למצוא את התנאים האופטימליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
העבודה נתמכה על ידי מענק לא. 01GU0615 של "Bundesministerium für und Forschung Technologie (BMBF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Biochrom AG | 214050 | |
| Amphotericin B | Biochrom AG | A2612 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline-PBS (10 x) | Invitrogen GmbH | 14080048 | |
| E. coli ceq221 | Cequent Pharmaceuticals Inc. | No catalogue available, direct order | |
| Gentamycin | Biochrom AG | A2710 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen GmbH | Contains 5,000 units of penicillin (base) and 5,000 μg of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline. | |
| Sodium chloride | Merck KgaA | 1064060500 | |
| Tryptone | Difco Laboratories | 211705 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 212750 |
References
- Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells. Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).
- Lage, H. MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance. Curr. Drug Targets. 7, 813-821 (2006).
- Lage, H. An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem. Cell. Mol. Life Sci. 65, 3145-3167 (2008).
- Lage, H. Therapeutic potential of RNA interference in drug-resistant cancers. Fut. Oncol. 5, 169-185 (2009).
- Nguyen, T. A., Fruehauf, J. H. Transkingdom RNA interference (tkRNAi): a novel method to induce therapeutic gene silencing. Methods Mol. Biol. 514, 27-34 (2009).
- Nieth, C., Priebsch, A., Stege, A., Lage, H. Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi. FEBS Lett. 545, 144-150 (2003).
- Stege, A., Priebsch, A., Nieth, C., Lage, H. Stable and complete overcoming of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference. Cancer Gene Ther. 11, 699-706 (2004).
- Stein, U. Complete in vivo reversal of the multidrug resistance (MDR) phenotype by jet-injection of anti-MDR1 short hairpin RNA-encoding plasmid DNA. Mol. Ther. 16, 178-186 (2008).
- Xiang, S., Fruehauf, J., Li, C. J. Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals. Nat. Biotechnol. 24, 697-702 (2006).
