Summary
För utveckling av RNA-interferens (RNAi)-baserade terapier, var en roman strategi utvecklats, transkingdom RNAi (tkRNAi). Denna teknik använder icke-patogena bakterier att producera och leverera terapeutiska korta hårnål RNA (shRNA) i målceller. Här var tkRNAi framgång använts för återföring av klassisk ABCB1-medierad multidrogresistensgenen (MDR) av cancerceller.
Abstract
RNA-interferens (RNAi) är en hög effektiv mekanism för specifika hämning av mRNA uttryck. Förutom dess potential som ett kraftfullt laboratorium verktyg verkar RNAi väg att lovande för terapeutisk användning. För utveckling av RNA-interferens (RNAi)-baserade terapier, leverans av RNAi-förmedlande agenter till målceller är en av de största hindren. En roman strategi för att övervinna detta hinder är transkingdom RNAi (TK RNAi). Denna teknik använder icke-patogena bakterier, t.ex. Escherichia coli, att producera och leverera terapeutiska korta hårnål RNA (shRNA) i målceller att inducera RNAi. En första generationens tk RNAi-medla vektor, TRIP, innehåller bakteriofag T7 promotor för uttryck reglering av ett terapeutiskt shRNA av intresse. Dessutom har resan Inv locus från Yersinia pseudotuberculosis som kodar invasin, som tillåter naturlig icke-invasiv bakterier att komma in β1-integrin-positiv däggdjursceller och HlyA genen från Listeria monocytogenes, som producerar listeriolysin O. Detta enzym kan den terapeutiska shRNA att fly från inträde blåsor i cytoplasman i målcellen. TRIP konstruktioner införs till en kompetent icke-patogena Escherichia coli stam som kodar T7 RNA-polymeras är nödvändiga för T7 promotorn driven syntes av shRNAs. En väldefinierad cancer-associerade målmolekyl för olika RNAi strategier ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Denna ABC-transportör fungerar som en drog extrudering pump och förmedlar den "klassiska" ABCB1-medierad multidrogresistensgenen (MDR) fenotyp av mänskliga cancerceller som kännetecknas av en viss korsresistens mönster. Olika ABCB1-uttryckande MDR cancerceller behandlades med anti-ABCB1 shRNA uttryck vektor med E. coli. Detta förfarande resulterade i aktivering av RNAi banorna inom cancerceller och en betydande ner reglering av ABCB1 kodning mRNA samt motsvarande drogen extrudering pump. Följaktligen var ackumulering av läkemedlet förbättras i den orörda resistenta cancerceller och MDR fenotypen den omvända. Med hjälp av denna modell uppgifterna ger proof-of-concept som tk RNAi är lämplig för modulering av cancer-associerade faktorer, t.ex. ABCB1, i humana cancerceller.
Protocol
1) Bakteriell Leverans av shRNAs
- Innan du börjar med bakteriekultur, måste man förbereda LB-medium och LB-agar.
- För LB-medium väga jästextrakt (0,5% w / v), Bacto trypton (1,0% w / v) och NaCl (0,6% w / v) och späd dessa komponenter i aqua bidest. Det färdiga lösningar måste steriliseras i en autoklav och är sedan redo att användas.
- För LB-agarplattor Bacto agar (1,5% w / v) måste läggas till LB-mediet tidigare sterilisering.
- Hetta upp LB-agar i mikrovågsugnen tills LB-agar är fullständigt upplöst. Låt lösningen svalna tills flaskan kan röras lätt utan att bli bränd. Lägg kanamycin (100 mg / ml) för val av positiva kloner i ytterligare steg.
- Förbered LB-agarplattor vid ett laminärt flöde bänk (sterila förhållanden) genom att pipettera 20 ml av LB-agar lösningen i 10-cm Petri-rätter. Låt plattorna svalna tills vätskan har blivit fast. Plattorna är nu redo att använda och kan lagras vid 4 ° C.
- ShRNA-kodning expressionsvektorer omvandlas till behöriga E. coli ceq221 av värme chock med CaCl 2 proceduren.
- Tavla det transformerade bakterier på LB-agarplattor innehållande 100 mikrogram / ml kanamycin, stäng locket, försegla tallrikar med parafilm och odla upp och ner vid 37 ° C över natten.
- Inokulera bakteriell mini kulturer med positiva kloner genom att plocka vuxit kolonier med en tandpetare. Överför tandpetare i 7,0 ml rent LB-medium som innehåller 100 mg / ml kanamycin och odla vid 37 ° C över natten på en shaker på 200 rpm.
- Inokulera 100 ml färsk LB-medium som innehåller 100 mg / ml kanamycin 1:100 med den över natten mini kultur i en 1 l Erlenmeyerkolv och inkubera vid 37 ° C över natten på en shaker på 200 rpm.
- Seed 25 x 10 4 (antal seedade celler beror på hastigheten av celltillväxt i enlighet cellinje, confluency ska vara ~ 70-80% 24 timmar efter sådd) mänskliga gastric cancer celler (EPG85-257RDB) per brunn i 6 - väl rätter och inkubera dessa vid 37 ° C, i en 5% CO 2, vattenånga mättade luften över natten.
- Föregående till cancercell infektion, över natten kulturer tk RNAi vektor innehållande E. coli mäts i en fotometer för att bestämma OD 600. Späd den bakteriella lösning tills en optisk densitet på 0,5 uppnås (OD 600 = 0,5 motsvarar 1,6 x 10 8 bakteriella celler / ml).
- Byt FCS-innehållande medel cellodling av cancer celler mot FCS-fria medel 30 min tidigare för att bakteriell samtidig inkubering.
- Tvätta bakterier två gånger med 1 x PBS, och späd i serum-fri Leibovitz L-15 medium.
- Lägg utspädd bakterier till cancerceller i önskad MOI (mångfald av infektion = antal bakterieceller per cancer cell) och co-inkubera bakterier och cancerceller i 2 timmar vid 37 ° C.
- Efter 2 timmar av samtidig inkubering cancerceller spolades två gånger med 1x x PBS och en gång med serum som innehåller Leibovitz L-15 mediet kompletteras med 100 E / ml penicillin, 100 mikrogram / ml streptomycin, 2,5 mikrogram / ml amfotericin, 150 mikrogram / ml gentamicin, och 100 mikrogram / ml kanamycin.
- Fortsätt odla cancerceller vid 37 ° C, i en 5% CO 2, vattenånga mättad atmosfär.
- Effekterna av den bakteriella behandlingen kan visualiseras med fluorescerande mikroskopi, mätt med kvantitativ realtids-RT PCR på mRNA-nivå och genom Western Blot analys på proteinnivå och visas med funktionella analysmetoder såsom FACS analys, och cell analyser spridning. (Om så önskas, kan dessa förfaranden beskrivas i detalj).
2) representativa resultat
Om protokollet utförs korrekt, bör resultaten jämförbara med dem som visas nedan.
Fluorescensmikroskopi
Figur 1 visar en mänsklig gastric cancer cell tre timmar efter bakteriell behandling (en) i jämförelse med en obehandlad cell (B). Runt kärnan i det behandlade cellen, kan bakterier påvisas.
Figur 1: Fluorescerande mikroskopi mänskliga gastric cancer cellen efter bakteriell behandling (1:500) och en obehandlad mänskliga gastric cancer cell som kontroll, DAPI-färgning, DAPI bandpassfilter (Λem = 640 nm), 40x objektiv.
Kvantitativa realtids-RT PCR
I figur 2 kan en nedreglering av MDR1 mRNA på ca 70% (svart balk) ses efter behandling med terapeutisk bakterier. Föräldrarnas celler fungerar som en positiv kontroll på grund av bristen på MDR1 överuttryck. Den cellinje 257RDB p170 innehåller en plasmid som uttrycker anti-MDR1 shRNAs s tas som en direkt jämförelse av transkingdom RNAi teknik till andra RNAi tysta strategier. Den obehandlade resistenta cellinje EPG85-257RDB överuttryck MDR1, samma cellinje som behandlats med bakterier som saknar shRNA uttrycka plasmiden, och denna cellinje som behandlas med terapeutiska bakteriebärande en plasmid som uttrycker anti-MRP2 shRNAs togs som positiva kontroller.
Figur 2: Kvantitativa realtids-RT PCR MDR1 mRNA uttryck efter behandling med terapeutisk E. coli ceq221 uttrycka anti-MDR1 shRNAs (MOI 1: 500). Normalisering utfördes med hjälp av aldolase hushållning genen. Den MDR1/aldolase förhållandet obehandlade celler från cellinjer EPG85-257RDB sattes 100%. P-värden beräknas med hjälp av Students t-test (* = p <0,05, ** = p <0,005, *** = p <0,001).
Western blot-analys
Figur 3 visar att MDR1 nedreglering också ägde rum på proteinnivå efter bakteriell behandling. Det visar den saknar MDR1 uttryck av drogen känsliga föräldrarnas cellinje (EPG85-257P), den MDR1 uttryck för obehandlade resistenta cellinje (EPG85-257RDB) och MDR1 uttryck för det behandlade provet. En tydlig nedreglering av MDR1 av bacterially behandlade cellerna kan observeras. 
Figur 3: Western blot-analys MDR1 uttryck nivåer av obehandlade narkotikarelaterade känsliga EPG85-257P, den obehandlade läkemedelsresistenta EPG-257RDB, och EPG85-257RDB efter samtidig inkubering med E.. coli ceq221 + P43 MDR1. Primär Ab C219 1:100, och anti-aktin 1:5 000, sekundär Ab anti-mus 1:10 000.
Cytotoxicitet
Funktionell analys som cytotoxicitet visas i figur 4 är också indikatorer för fungerande transkingdom RNAi. Föräldrarnas cellinje och cellinje som innehåller en anit-MDR1 shRNA uttrycka plasmid visar ingen motståndskraft mot daunorubicin. Den resistenta cellinje EPG85-257RDB och två ytterligare kontroller inte visar signifikanta förändringar i motstånd i jämförelse med det prov som behandlats med anti-MDR1 shRNA uttrycka bakterier där motståndet mot Daunorubicin kunde vändas med ca 90%.
Figur 4: cytotoxicitet. Drogspecifika IC50-värden som bestäms genom en cytotoxicitet för cell överlevnad. P-värden beräknas med hjälp av Students t-test (* = p <0,05, ** = p <0,005, *** = p <0,001).
Antracyklin ackumulering analys
Enligt sänkt motstånd bacterially behandlade prover (Figur 4), är antracyklin ansamling av anti-MDR1 behandlas shRNA celler ökade med cirka 90% enligt figur 5. Föräldrarnas cellinje och cellinje 257RDB p170 visar en stark daunorubicin ackumulering upp till 100%. Den resistenta varianten visar sällan någon ackumulering. Celler som behandlats med anti-MDR1 shRNA uttrycka bakterier visar en anthracyline ansamling ökning med 90%.
Figur 5: antracyklin ackumulering analys. Antracyklin ansamling av cancer celler 6 dagar efter bakteriell behandling mätas med flödescytometri. P-värden beräknas med hjälp av Students t-test (* = p <0,05, ** = p <0,005, *** = p <0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cellen Antalet seedade för infektion och motsvarande MOI använts, kritiskt beroende av cellinjer under observation och deras hastighet av tillväxt. Att hitta optimala cell nummer för sådd, är pre-experiment för att bestämma hastigheten på tillväxt rekommenderas starkt. Utöver detta bör olika MOIS testas på grund av begränsad omfattning som cellerna tål bakteriell invasion utan att dö av stress. Den optimala tidpunkt då ner regleringen av gener under uppsikt kan variera. Det rekommenderas att utföra experiment under en viss tid för att hitta den optimala förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Arbetet stöddes av bidrag nr. 01GU0615 av "Bundesministerium für Forschung und Technologie (BMBF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Biochrom AG | 214050 | |
| Amphotericin B | Biochrom AG | A2612 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline-PBS (10 x) | Invitrogen GmbH | 14080048 | |
| E. coli ceq221 | Cequent Pharmaceuticals Inc. | No catalogue available, direct order | |
| Gentamycin | Biochrom AG | A2710 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen GmbH | Contains 5,000 units of penicillin (base) and 5,000 μg of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline. | |
| Sodium chloride | Merck KgaA | 1064060500 | |
| Tryptone | Difco Laboratories | 211705 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 212750 |
References
- Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells. Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).
- Lage, H. MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance. Curr. Drug Targets. 7, 813-821 (2006).
- Lage, H. An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem. Cell. Mol. Life Sci. 65, 3145-3167 (2008).
- Lage, H. Therapeutic potential of RNA interference in drug-resistant cancers. Fut. Oncol. 5, 169-185 (2009).
- Nguyen, T. A., Fruehauf, J. H. Transkingdom RNA interference (tkRNAi): a novel method to induce therapeutic gene silencing. Methods Mol. Biol. 514, 27-34 (2009).
- Nieth, C., Priebsch, A., Stege, A., Lage, H. Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi. FEBS Lett. 545, 144-150 (2003).
- Stege, A., Priebsch, A., Nieth, C., Lage, H. Stable and complete overcoming of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference. Cancer Gene Ther. 11, 699-706 (2004).
- Stein, U. Complete in vivo reversal of the multidrug resistance (MDR) phenotype by jet-injection of anti-MDR1 short hairpin RNA-encoding plasmid DNA. Mol. Ther. 16, 178-186 (2008).
- Xiang, S., Fruehauf, J., Li, C. J. Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals. Nat. Biotechnol. 24, 697-702 (2006).
