Summary
Здесь мы представляем иммунопреципитации хроматина (чип) процедура генома расположение анализ изоформ белков, отличающихся по гистонов-связывающий домен. Мы применяем его к чипу-Seq анализ, чтобы определить цели KDM5A/JARID1A/RBP2 гистонов деметилазы.
Abstract
Набор транскрипции и эпигенетических факторов к своим целям является ключевым шагом в их регулировании. Видное место при приеме на работу являются белковых доменов, которые связываются с конкретной модификации гистонов. Один из таких областей завод homeodomain (PHD), найденный в нескольких хроматина белки. Эпигенетические RBP2 фактор состоит из нескольких доменов PHD, однако, они имеют разные функции (рис. 4). В частности, С-концевой домен PHD, найденный в RBP2 онкогенных синтеза в лейкемии человека, связывается с trimethylated лизина 4 в гистона H3 (H3K4me3) 1. Стенограмма соответствующие изоформы RBP2 содержащих С-концевой PHD накапливается при дифференциации promonocytic, лимфома происхождения, U937 клеток в моноциты 2. В соответствии с обоих наборов данных, генома анализ показал, что в дифференцированных клетках U937, белка RBP2 получает локализован в геномных регионов обогащенного для H3K4me3 3. Локализация RBP2 своей цели коррелирует с уменьшением H3K4me3 из-за RBP2 гистонов деятельности деметилазы и снижение транскрипционной активности. В отличие от двух других кандидатов наук из RBP2 не в состоянии связать H3K4me3. Примечательно, что С-концевой домен кандидат RBP2 отсутствует в меньшей RBP2 изоформы 4. Вполне возможно, что небольшие изоформы RBP2, которому не хватает взаимодействия с H3K4me3, отличается от большей изоформы в геномных месте. Разница в геномных расположение RBP2 изоформ может быть причиной наблюдаемого многообразия в RBP2 функции. В частности, RBP2 является важнейшим игроком в клеточной дифференцировки посредничестве белок ретинобластомы (PRB). В соответствии с этими данными, предыдущие генома анализа, без различия между изоформ, определены две различные группы RBP2 генов-мишеней: 1) гены связаны RBP2 в манере, которая не зависит от дифференциации, 2) гены связаны RBP2 в дифференциации- зависимым образом.
Чтобы выявить различия в локализации между изоформ мы провели генома анализ местоположения, ChIP-Seq. Использование антител, которые обнаруживать как RBP2 изоформ мы расположены все RBP2 целей. Кроме того, мы антитела, которые связываются только большой, и не малые RBP2 изоформы (рис. 4). После выявления крупных целей изоформы, можно затем вычесть их из всех RBP2 цели выявить цели малых изоформ. Эти данные показывают, вклад хроматина взаимодействующих домена белка вербовки в свои сайты связывания в геноме.
Protocol
Протокол был изначально адаптирована из B. Ren, 2001. Она представляет собой небольшую модификацию протокола Одом и соавт. 5 видно, что можно найти на http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&f=appendices_downloads
1. Предварительно блок и связывание антител к магнитных шариков (должен быть выполнен в ночь перед следующему шагу)
- Вымойте 100 мкл Dynabeads Protein G (на IP, объединить для нескольких IP-адресов) в 1 мл свежей BSA / PBS решение (50 мг BSA в 10 мл PBS-Это решение будет длиться в течение одной недели).
- Сбор бусин с помощью магнитного стоять и повторите процедуру промывки еще два раза.
- Затем добавьте 10 мкг антител к 250 мкл суспензии в бисер PBS / BSA решение (в IP) и инкубировать ночь на вращающейся платформе, при 4 ° C.
- По окончании мытья бисером три раза в 1 мл PBS / BSA раствором, а затем ресуспендируют в 10 мкл PBS / BSA решение (в IP).
2. Сотовые сшивания
- Чтобы начать эту процедуру, растут примерно 10 8 клеток для каждого иммунопреципитации или IP. Здесь, диффузный гистиоцитарной клетки лимфомы U937 используется и индуцированных для моноцитов дифференцирование TPA в течение 96 часов.
- После роста клеток, добавить раствор формальдегида непосредственно к СМИ, чтобы конечная концентрация 1%. Затем вихрь колбы кратко и дать им возможность сидеть при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем, аспирация СМИ и промыть клетки с 15 мл ледяной PBS. Повторите это мыть один раз.
- Затем добавьте 6 мл лизирующего буфера 1 (50 мМ HEPES-KOH, рН 7,5, 140 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10% глицерина, 0,5% NP-40, 0,25% Тритон Х-100, содержащий ингибиторы протеазы) каждому из колбы на льду. Затем, рок колбы в течение 20 минут при 4 ° C.
- Наконец, урожай клеток с использованием ячейки скребком и передавать их на 15 мл конические пробирки. В этот момент клетки могут храниться при температуре -80 ° C.
3. Сотовые ультразвуком
- Если клетки были заморожены, оттепель их. После оттаивания спина ячейки вниз при 3000 оборотов в минуту в течение 10 минут при 4 ° С и отбросить супернатант. Затем, ресуспендирования клеток в 6 мл лизирующего буфера 2 (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 200 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ EGTA, содержащий ингибиторы протеазы). Рок труб осторожно при комнатной температуре в течение 10 минут.
- Повторите центрифугирования и ресуспендирования клеток в 2,5 мл лизирующего буфера 3 (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ EGTA, 0,1% натрия дезоксихолата, 0,5% N-lauroylsarcosine, содержащий ингибиторы протеаз) .
- Далее готовить суспензии для обработки ультразвуком, поместив его в стакан ледяной воды с микроострийных из Брэнсон 450 Sonifier установлен между 50 и 60% амплитуды.
- Разрушать ультразвуком решение для 30-секундного постоянной лопаются и прохладной на льду в течение 1 минуты. Повторите эти импульсы от 10 до 15 раз. Затем, пипетки содержимое пробирки вверх и вниз, и передавать их на новые трубы. Продолжайте импульса и прохладный решение еще 5 раз.
- После обработки ультразвуком, добавить 10% Тритон Х-100 до 1 / 10 объема раствора. Передача лизаты до 1,5 мл трубы центрифуги, и спина мусора в микроцентрифужных. Затем перенесите Клеточный лизат в новую пробирку.
4. Хроматин Иммунопреципитация
- До хроматин иммунопреципитации, или чип, за исключением 50 мкл клеточного лизата в качестве входного образца. Затем объединить очищается Клеточный лизат с Dynabeads предварительно связаны с антителами, которые были ранее получены, как описано выше. Рок смеси, в дополнение к 50 мкл образца ввода, при 4 ° С в течение ночи.
- Вымойте бисер с 1 мл промывочного буфера (50 мМ HEPES-KOH, рН 7,6, 0,5 М LiCl, 1 мМ ЭДТА, 0,7% натрия дезоксихолата, 1% NP-40). Затем, используя магнитный стенд собирать бусы и удалите супернатант. Повторите это мыть 6 до 8 раз.
- Выполните окончательное промыть 1 мл ТЕ-плюс-50 мМ NaCl (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА). Спиновые бусины микроцентрифужных при 3000 оборотов в минуту в течение 2 минут при 4 ° C. После центрифугирования, аспирации остаточного буфера ТЕ.
- Затем добавьте 100 мкл элюции буфера (50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 1% SDS) для образцов. Сразу же после инкубации образцов при 65 ° С в течение 10 до 15 минут. Царапины труб против 1,5 мл трубки стойку каждые 2 минуты, чтобы держать четки в суспензии.
- Сбор бисером использованием центрифугирования и магнитных стоять, и передача супернатант для ПЦР-пробирку. Затем, получить ранее сохраненный входной выборки и добавьте 3 объема элюции буфера.
- Наконец, поместите IP и ввода образцов в термоциклер ночь при 65 ° С дообратном перекрестные связи.
- На следующий день, добавить 1 объем буфера TE для образцов. Затем добавьте РНКазы, чтобы конечная концентрация 0,2 мкг / мкл. Инкубируйте образцы в термоциклер от 1 до 2 часов при температуре 37 ° C.
- После инкубации добавить протеиназы К до конечной концентрации 0,2 мкг / мкл. Затем, инкубировать образцов в термоциклер при 55 ° С в течение 2 часов.
- Затем экстракт образцы один раз с одним объемом фенола. Извлечение образцов второй раз с одним объемом фенол: хлороформ: изоамиловый спирт. Наконец, извлекать образцы еще раз с одним объемом хлороформ: изоамиловый спирт.
- Затем добавьте 30 мкг гликогена в каждом образце. Кроме того, добавляют NaCl до конечной концентрации 0,2 Молярная и двумя объемами этанола в образцах. Инкубировать их в течение 30 минут при температуре -80 ° C. После инкубации спина образцов и переливать супернатант. Вымойте гранулы с 500 мкл 75% этанола. Затем, сухие гранулы и повторно приостанавливать их в 40 мкл воды.
- Для проверки размеров фрагментов ДНК производится путем обработки ультразвуком процедуры, нагрузка 5 мкг очищенного входной выборки в 1,8% агарозном геле и запустить геля. Ультразвука процедура должна производить фрагментов в диапазоне 150-350 пар оснований. Однако, если фрагменты не находятся в этом диапазоне, ультразвуком процедуры должны быть скорректированы при изменении числа всплесков и амплитудой.
- Для проверки надежности и специфика ChIP, обогащение контроль обязательным регионах, выполняя ген-специфической ПЦР с 1 мкл IP образцов и разведения серии входного образца. Два-три «привязан» регионы и области несвязанного контроля должны быть выбраны для того, чтобы проверить качество IP и ввода проб.
5. Усиление геномной ДНК
- Начиная с 34 мкл IP образца или 200 нг входного образца конца выполнить ремонт, '' Кроме того хвост и лигирования адаптеров для ДНК-фрагментов с использованием геномной ДНК Пример Подготовка комплекта http://www.illumina.com/systems/ genome_analyzer.ilmn (Illumina, Inc, Сан-Диего, Калифорния).
- Purify ДНК с использованием ПЦР MinElute Очистка Kit, а затем вымывается его в буфер EB (10 мМ Tris Cl, рН 8,5), который был предварительно нагревают до 50 ° C. Например, можно использовать 23 мкл и 46 мкл для окончательного вымывания IP и образцы входных ДНК, соответственно.
- Сделайте ПЦР-реакции с помощью 23 мкл ДНК с адаптерами и 25 мкл ДНК-полимеразы Phusion из комплекта, 1 мкл 20 мкМ Sol_PCR_1 и 1 мкл 20 мкМ Sol_PCR_2. Выполнить ПЦР реакции следующим образом: 1) 30 секунд при 98 ° С; 2) 10 секунд при 98 ° С; 3) 30 секунд при температуре 65 ° С; 4) 30 секунд при температуре 72 ° С; повторяя шаги шаги 2-4, 18 раз, а затем 5 минут при 72 ° С, в конце концов холдинг при 4 ° C.
- После ПЦР-амплификации, очистить ДНК QIAGEN MinElute Kit Очистка ПЦР. Предварительно теплой 15 мкл буфера EB до 50 ° С и элюции ДНК. Развести 0,5 мкл образца 1:4 и выполнять Nanodrop чтения.
6. Гель очистки амплифицированных продуктов
- Для очистки усиленный продукты, готовить 1,8% агарозном геле 50 мл использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии класса воды. Добавить TAE и бромистый этидий после агарозном не растает. Затем налить гель. Нагрузка гель после добавления 4 мкл загрузки буфера для входа и IP-проб. Затем запустите гель на 120 вольт в течение 45 минут.
- Анализ гель после его запуска. Гель должен показать, что фрагменты в диапазоне между 150 и 350 пар оснований производятся. Они представляют геномных фрагментов ДНК от 50 до 250 пар оснований в длину и адаптер.
- Акцизный область геля, содержащего материала в 150 350 пар оснований диапазоне с помощью скальпеля. Будьте осторожны, чтобы избежать вырезания адаптер-переходник группа, которая работает на частоте около 120 пар оснований. Восстановление ДНК с использованием Добыча QIAquick Гель комплект в соответствии с инструкциями производителя. В частности, использовать один столбец из Добыча Kit Гель QIAquick для геля 400 мг или меньше. Чтобы начать процесс извлечения, добавить 3 объема QG буфера до 1 объема геля. Добавить 1 объем изопропанола и нагрузки смеси на колонке. Используйте 0,5 мл QG мыть колонке, а затем стандартной процедуре, описанной в комплект руководства. Использование Н 2 О предварительно нагревают до 50 ° C для элюирования ДНК. Инкубируйте колонку с 30 мкл H 2 O в течение 5 минут при 37 ° С до спиннинг его вниз.
- Сухой образец до 11 мкл именно в Speedvac без тепла. Удалить 1 мкл пробы и измерения концентрации ДНК использованием Nanodrop спектрофотометр.
- Наконец, определить обогащенные продукты с использованием генной Illumina AnalyzerIIe генома, как описано в http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/ 2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf 6.
7. Представитель Результаты
Рисунок 1. Общая цель следующего эксперимента является определение геномной целей KDM5A/JARID1A/RBP2 гистонов деметилазы.
(P1) Это достигается за счет подготовки сшитого хроматина, который обрабатывали ультразвуком, чтобы произвести фрагменты ДНК соответствующего размера. (P2) В качестве второго шага, RBP2 связаны фрагменты ДНК иммунопреципитации с RBP2 антител. (P3) Далее, восстановленные фрагменты ДНК отремонтировано на концах и адаптеры лигировали на концы геномной ДНК, чтобы подготовить библиотеки геномной ДНК для анализа на потоке клеток в Illumina станции кластера. ДНК библиотек усиливаются методом ПЦР с использованием небольшого числа циклов. (Р4), наконец, освещения последовательность коротких чтение однозначно увязаны с геномом человека, значимых пиков определены и аннотированный до ближайшего генов с целью выявления RBP2 обогащенного регионах. (С-5) Получены результаты, которые показывают молекулярно функций, связанных с RBP2 генов-мишеней на основе генома идентификации RBP2 области, обогащенные.
Рисунок 2. Проверка результатов хроматина ультразвуком Для проверки размеров фрагментов ДНК производится путем обработки ультразвуком процедуры, 5 мкг (1 / 10) очищенный входной образец был погружен на 1,8% агарозном геле. Как и ожидалось, наша процедура производится ультразвуком фрагментов в диапазоне 150-350 б.п.. Однако, если фрагменты не находятся в этом диапазоне, ультразвука процедура должна быть соответствующим образом скорректированы, варьируя число всплесков и амплитудой.
Рисунок 3. Гель очистки усиленный продукции. ПЦР-продукты работают на гель для удаления адаптеры и выберите размер дальности шаблонов для платформы поколения кластера. Этот гель показывает, что фрагменты в диапазоне между 150 и 350 пар оснований, были произведены. Они представляют геномных фрагментов ДНК от 50 до 250 пар оснований в длину и адаптер. Мы акцизного выбранного региона геля с помощью скальпеля. Следует проявлять осторожность, чтобы избежать адаптер-переходник группа, которая работает на частоте около 120 пар оснований.
Рисунок 4. Изоформы-специфических антител позволяет различия между большими и малыми изоформы RBP2. RBP2 структуры белка представлен в доменном представлении. RBP2 содержит несколько доменов: каталитическая гистонов деметилирования JmjC домен и связанные с ними JmjN домена, домен АРИДНЫХ способны последовательности конкретных обязательных ДНК, C5HC2 пальцем цинка, которые потенциально могут взаимодействовать с ДНК или других белков, и несколько доменов PHD. Два противотанковых RBP2 антитела, которые позволяют различия между RBP2 изоформы были получены от RBP2 фрагменты указанных жирными линиями.
На рисунке 5а. Обзор RBP2 обязательным регионов вместе с хромосомой и Ensembl генов. Геномная координаты определены обогащенного RBP2 (все изоформы и крупные изоформы) связывание регионам представлены хромосомы мудрым. Occupances из Ensembl генов (версия 54; hg18) в хромосомы (хромосомы 10 в этой картине) представлены в виде черных полос (верхняя часть). Каждый RBP2 связывающей области представляется в виде вертикальной линии, где средняя панель показывает все RBP2 изоформ обязательным регионов на хромосоме 10, а нижняя панель показывает RBP2 большой изоформы обязательным регионах. Средней и нижней панели дают обзор перекрытия и конкретные занятость RBP2 изоформ на хромосоме 10.
На рисунке 5б. Функциональный анализ обогащения RBP2 генов-мишеней. Тепловая карта показывает FDR исправлены достоверно (р-значение ≤ 0,05) обогащенного GO молекулярной категорий Функция среди генов связаны (ближайший гены RBP2 обязательным область) RBP2 (все и крупных изоформ). Цвета к красным, указывают на высокую значимость статистики, желтый указывает на низкий значение статистики, и серый указывает на отсутствие статистики значение. Обогащение анализ показывает, перекрытия и изоформы конкретные молекулярные функции RBP2 генов-мишеней.
Discussion
Функциональные различия между RBP2 изоформ не были определены. Мы использовали комплексный подход для выявления генома связаны RBP2 изоформ и определить функциональные категории, что эти области представляют. Это было достигнуто путем ChIP-Seq анализа следует биоинформатики анализ полученной последовательности чтения.
RBP2 модифицирует метилированный остатков лизина на гистоновых хвостов. Мы обнаружили, что большая RBP2 изоформы содержащие признание модуль для метилированных гистонов лизина и RBP2 небольшой изоформы не хватает этого модуля связываются в различные регионы в геноме человека (рис. 5А). Важно отметить, что изоформы конкретные регионы и сопредельные регионы принадлежат генов с различной молекулярной функции (рис. 5B). Например, "хроматина обязательные» и «связывания транскрипционных факторов» функции могут быть приписаны гена целями RBP2 небольшой изоформы но не RBP2 большой изоформы (рис. 5B). Сравнивая фактические гена наборами, сформированными для всех изоформ и RBP2 большой изоформы (данные не представлены), мы также можем определить, если большая изоформы специально нанят для определенных генов.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана 115347-RSG-08-271-01-GMC от ACS, а также CA138631 грант NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F79500 | |
| BSA | USB Corp., Affymetrix | 10852 | |
| chloroform/isoamyl alcohol | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Genomic DNA Sample Prep Kit | Illumina | FC-102-1001 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| glycogen | Boehringer Ingeheim | 901393 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250-500 | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | |
| Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| N-lauroyl sarcosine | MP Biomedicals | 194008 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| PBS | Fisher Scientific | mt21040cv | |
| phenol | Sigma-Aldrich | P-4557 | |
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | F-540S | |
| proteinase K | GIBCO, by Life Technologies | 25530-049 | |
| QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| MinElute PCR purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| RNAse A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| SDS | Invitrogen | 24730020 | |
| TE (endofree for maxi-prep kit) | Qiagen | 19048 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151100 | |
| Ultra Agarose, Certified low-range | Bio-Rad | 161-3106 | |
Oligonucleotide sequences 2006 Illumina, Inc. All rights reserved.
|
|||
References
- Wang, G. G. Haematopoietic malignancies caused by dysregulation of a chromatin-binding PHD finger. Nature. 459 (7248), (2009).
- Benevolenskaya, E. V. Binding of pRB to the PHD protein RBP2 promotes cellular differentiation. Mol Cell. 18 (6), 623-623 (2005).
- Lopez-Bigas, N. Genome-wide analysis of the H3K4 histone demethylase RBP2 reveals a transcriptional program controlling differentiation. Mol Cell. 31 (4), 520-520 (2008).
- Benevolenskaya, E. V. Histone H3K4 demethylases are essential in development and differentiation. Biochem Cell Biol. 85 (4), 435-435 (2007).
- Odom, D. T. Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors. Science. 303 (5662), 1378-1378 (2004).
- Guenther, M. G. Aberrant chromatin at genes encoding stem cell regulators in human mixed-lineage leukemia. Genes Dev. 22 (24), 3403-3403 (2008).
