Summary
Qui stiamo presentando un immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) procedura per la genoma analisi posizione di isoforme di proteine che si differenziano in un istone-dominio di legame. Lo stiamo applicando a ChIP-Seq analisi per identificare gli obiettivi del demetilasi KDM5A/JARID1A/RBP2 istoni.
Abstract
Reclutamento di fattori trascrizionali ed epigenetici ai loro obiettivi è un passo fondamentale nella loro regolazione. Prominente nel reclutamento sono i domini di proteine che si legano a specifiche modificazioni degli istoni. Un dominio tale è la omeodominio pianta (PHD), che si trova in diversi cromatina proteine leganti. Il RBP2 fattore epigenetico è più domini PHD, tuttavia, essi hanno funzioni diverse (Figura 4). In particolare, il C-terminale del dominio PHD, che si trova in una fusione RBP2 oncogeno nella leucemia umana, si lega a trimetilato lisina 4 di H3 (H3K4me3) 1. La trascrizione corrispondente alla isoforma RBP2 contenente il C-terminale PHD accumula durante la differenziazione di promonocytic, linfoma di derivazione, U937 in monociti 2. Coerentemente con due serie di dati, genoma analisi ha mostrato che in cellule U937 differenziate, la proteina RBP2 viene localizzata alle regioni genomiche altamente arricchito per H3K4me3 3. Localizzazione di RBP2 ai suoi obiettivi è correlato con una diminuzione a causa di H3K4me3 RBP2 attività demetilasi istoniche e una diminuzione dell'attività trascrizionale. Al contrario, gli altri due dottorati di RBP2 non sono in grado di legare H3K4me3. In particolare, il C-terminale del dominio PHD RBP2 è assente nel RBP2 piccoli isoforma 4. È ipotizzabile che l'isoforma piccolo RBP2, a cui manca l'interazione con H3K4me3, differisce dalla isoforma più grande in posizione genomica. La differenza di posizione genomica di RBP2 isoforme potrebbe spiegare le diversità osservate in RBP2 funzione. In particolare, RBP2 è un giocatore fondamentale nella differenziazione cellulare mediata dalla proteina retinoblastoma (pRB). Coerentemente con questi dati, precedenti analisi genome-wide, senza distinzione tra isoforme, identificati due gruppi distinti di RBP2 geni bersaglio: 1) i geni legati da RBP2 in un modo che è indipendente dalla differenziazione; 2) i geni legati da RBP2 in una differenziazione- modo dipendente.
Per identificare le differenze nella localizzazione tra le isoforme abbiamo effettuato analisi genome-wide posizione di Chip-Seq. Utilizzando anticorpi che rilevano entrambe le isoforme RBP2 abbiamo localizzato tutti RBP2 obiettivi. Inoltre abbiamo gli anticorpi che si legano solo di grandi dimensioni, e non piccolo RBP2 isoforma (Figura 4). Dopo aver identificato gli obiettivi isoforma di grandi dimensioni, si può poi sottrarre da tutte le RBP2 obiettivi per rivelare gli obiettivi della isoforma di piccole dimensioni. Questi dati mostrano il contributo della cromatina interagenti dominio nel reclutamento di proteine per la sua siti di legame nel genoma.
Protocol
Il protocollo è stato originariamente adattato da B. Ren, 2001. Esso rappresenta una leggera modifica del protocollo da parte Odom et al. 5 che sono disponibili all'indirizzo http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&f=appendices_downloads
1. Pre-blocco e vincolante di anticorpi sfere magnetiche (deve essere eseguita la sera prima del punto successivo)
- Lavare 100 l di Dynabeads proteina G (per IP, si combinano per IP multipli) in 1 ml di fresca BSA / PBS soluzione (50 mg in 10 ml di BSA PBS-Questa soluzione durerà una settimana).
- Raccogliere le perle utilizzando un supporto magnetico e ripetere la procedura di lavaggio altre due volte.
- Successivamente, aggiungere 10 mg di anticorpo a 250 microlitri della sospensione sfere in PBS / BSA soluzione (per IP) e incubare una notte su una piattaforma rotante a 4 ° C.
- Al termine, lavare le perle tre volte in 1 ml di PBS / BSA soluzione e quindi risospendere in 10 ml di PBS / BSA soluzione (per IP).
2. Cellula di cross-linking
- Per iniziare questa procedura, crescono di circa 10 8 cellule per immunoprecipitazione, o IP. Qui, diffusa istiocitica cellule U937 linfoma vengono utilizzati e indotto per la differenziazione monocitica con TPA per 96 ore.
- In seguito la crescita cellulare, aggiungere soluzione di formaldeide direttamente sul supporto ad una concentrazione finale di 1%. Poi, agitare brevemente fiaschi e permettere loro di stare a temperatura ambiente per 10 minuti. Poi, aspirare i media e lavare le cellule con 15 ml di PBS ghiacciato. Ripetere questa lavare una volta.
- Successivamente, aggiungere 6 ml di Lysis Buffer 1 (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glicerolo, 0.5% NP-40, 0,25% Triton X-100, contenente inibitori della proteasi) ad ogni dei flaconi sul ghiaccio. Poi, il rock i palloni per 20 minuti a 4 ° C.
- Infine, raccogliere le cellule utilizzando un raschietto cellulare e trasferirli a 15 mL conica. A questo punto le cellule possono essere conservati a -80 ° C.
3. Cellula sonicazione
- Se le cellule sono state congelate, li disgelo fuori. Una volta scongelato, girare le celle in basso a 3.000 giri per 10 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante. Poi, risospendere le cellule in 6 ml di Lysis Buffer 2 (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, contenenti inibitori della proteasi). Roccia delicatamente le provette a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Ripetere centrifugazione e risospendere le cellule in 2,5 ml di Lysis Buffer 3 (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, deossicolato di sodio 0,1%, 0,5% N-lauroylsarcosine, contenenti inibitori della proteasi) .
- Quindi, preparare la sospensione per sonicazione mettendo in un bicchiere di acqua ghiacciata con l'microtip di un 450 Branson Sonifier impostata tra il 50 e il 60% di ampiezza.
- Sonicare la soluzione per 30 secondi una raffica costante e freddo in ghiaccio per 1 minuto. Ripetere questi impulsi 10 a 15 volte. Poi, pipetta il contenuto della provetta su e giù e trasferirli in una nuova provetta. Continuare a impulsi e raffreddare la soluzione di un ulteriore 5 volte.
- A seguito di sonicazione, aggiungere il 10% Triton X-100 a 1 / 10 il volume della soluzione. Trasferire i lisati ai tubi da 1,5 ml per centrifuga, e spin i detriti in microcentrifuga. Poi trasferire il lisato cellulare in una nuova provetta.
4. Immunoprecipitazione della cromatina
- Prima di immunoprecipitazione della cromatina, o chip, risparmiare 50 ml di lisato cellulare come il campione di ingresso. Poi, unire il lisato cellulare cancellato con Dynabeads pre-legato all'anticorpo che sono stati precedentemente preparato come descritto sopra. Roccia il composto, oltre al campione di ingresso di 50 microlitri, a 4 ° C durante la notte.
- Lavare le perline con 1 ml di tampone di lavaggio (50 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 0,5 M LiCl, 1mM EDTA, sodio desossicolato 0,7%, 1% NP-40). Quindi, utilizzare un supporto magnetico per raccogliere le perline e rimuovere il surnatante. Ripetere questa lavare 6 a 8 volte.
- Eseguire un lavaggio finale con 1 ml TE-più-50 mM NaCl (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). Spin le perle in una microcentrifuga a 3.000 rpm per 2 minuti a 4 ° C. Dopo la centrifugazione, aspirare ogni residuo di tampone TE.
- Poi, aggiungere 100 ml di tampone di eluizione (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS) per i campioni. Immediatamente dopo, incubare i campioni a 65 ° C per 10 a 15 minuti. Graffiare i tubi contro un rack tubo 1,5 ml ogni 2 minuti per mantenere le microsfere in sospensione.
- Raccogliere le perline mediante centrifugazione e il supporto magnetico, e trasferire il surnatante in una provetta da PCR. Poi, recuperare il campione di input precedentemente salvato e aggiungere 3 volumi di tampone di eluizione.
- Infine, posizionare i campioni di IP e di ingresso nel termociclatore notte a 65 ° Cinvertire la cross-legami.
- Il giorno seguente, aggiungere 1 volume di tampone TE ai campioni. Quindi, aggiungere RNase A per una concentrazione finale di 0,2 mg / mL. Incubare i campioni nel termociclatore per 1 o 2 ore a 37 ° C.
- Dopo l'incubazione, aggiungere proteinasi K alla concentrazione finale di 0,2 mg / mL. Poi, incubare campioni nel termociclatore a 55 ° C per 2 ore.
- Successivamente, estrarre i campioni di una volta con un volume di fenolo. Estrarre i campioni per la seconda volta con un volume di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico. Infine, estrarre i campioni ancora una volta con un volume di cloroformio: alcool isoamilico.
- Poi, aggiungere 30 mg di glicogeno per ogni campione. Inoltre, aggiungere NaCl ad una concentrazione finale di 0,2 volumi molari e due di etanolo ai campioni. Incubare per 30 minuti a -80 ° C. Dopo l'incubazione, spin i campioni e decantare il surnatante. Lavare il pellet con 500 ml di etanolo 75%. Poi, asciugare il pellet e li risospendere in 40 ml di acqua.
- Per controllare le dimensioni dei frammenti di DNA prodotti dalla procedura di sonicazione, carico 5 mg del campione in ingresso purificato in un gel di agarosio 1,8% ed eseguire il gel. La procedura di sonicazione dovrebbe produrre frammenti nel range di 150-350 paia di basi. Tuttavia, se i frammenti non rientrano in questo intervallo, la procedura di sonicazione deve essere regolata variando il numero di scoppi e l'ampiezza.
- Per controllare la robustezza e la specificità di ChIP, l'arricchimento nelle regioni di controllo vincolanti eseguendo gene-specifico PCR con 1 ml di campioni IP e una serie di diluizioni del campione in ingresso. Due o tre "legato" le regioni e una regione controllo non associato devono essere selezionati in modo da testare la qualità dei campioni di IP e di ingresso.
5. Amplificazione del DNA genomico
- A partire con 34 ml di campione IP o 200 ng di campione di input, effettuare la riparazione fine, 'A' aggiunta la coda e la legatura di adattatori per frammenti di DNA utilizzando DNA genomico Sample Prep Kit http://www.illumina.com/systems/ genome_analyzer.ilmn (Illumina, Inc., San Diego, CA).
- Purificare il DNA con un MinElute PCR Purification Kit e poi eluire nel buffer EB (10 mM Tris Cl, pH 8,5) che è stato pre-riscaldato a 50 ° C. Ad esempio, utilizzare 23 microlitri e 46 microlitri per l'eluizione finale di IP e di campioni di DNA di ingresso, rispettivamente.
- Fai la reazione di PCR utilizzando 23 ml di DNA con adattatori, e 25 microlitri DNA polimerasi Phusion dal kit, 1 ml di 20 mM Sol_PCR_1 e 1 ml di 20 mM Sol_PCR_2. Eseguire la reazione di PCR come segue: 1) 30 secondi a 98 ° C; 2) 10 secondi a 98 ° C; 3) 30 secondi a 65 ° C; 4) 30 secondi a 72 ° C, ripetendo i passaggi passo 2-4 18 volte e poi 5 minuti a 72 ° C, infine, tenendo a 4 ° C.
- A seguito di amplificazione PCR, purificare il DNA con il kit di purificazione QIAGEN MinElute PCR. Preriscaldare 15 ml di tampone EB a 50 ° C ed eluire il DNA. Diluire 0,5 ml di campione 1:4 e di eseguire una lettura NanoDrop.
6. Purificazione gel di prodotti amplificati
- Per purificare i prodotti amplificati, preparare un gel di agarosio 1,8% di 50 ml utilizzando HPLC acqua. Aggiungi TAE e bromuro di etidio dopo l'agarosio si è sciolto. Poi, versare il gel. Caricare il gel dopo l'aggiunta di 4 ml di tampone di caricamento per l'ingresso e campioni IP. Quindi, eseguire il gel a 120 volt per 45 minuti.
- Analizzare il gel dopo la sua esecuzione. Il gel dovrebbe rivelare che i frammenti della gamma sono prodotti tra 150 e 350 paia di basi. Essi rappresentano frammenti di DNA genomico tra 50 e 250 paia di basi di lunghezza e un adattatore.
- Accise della regione di gel contenente il materiale nella 350 150 serie di coppie di basi con un bisturi. Fate attenzione a non asportare l'adattatore adattatore fascia, che corre a circa 120 paia di basi. Recuperare il DNA utilizzando un kit di Gel QIAquick estrazione secondo le istruzioni del produttore. In particolare, utilizzare una colonna del kit di estrazione Gel QIAquick per una fetta di gel di 400 mg o meno. Per iniziare il processo di estrazione, aggiungere 3 volumi di tampone QG di 1 volume di gel. Aggiungere 1 volume di isopropanolo e caricare il composto sulla colonna. L'uso 0,5 ml di QG per lavare la colonna, seguita da procedura standard descritta in kit manuale. Usare H 2 O pre-riscaldato a 50 ° C per eluire il DNA. Incubare la colonna con 30 ml di H 2 O per 5 minuti a 37 ° C prima della filatura verso il basso.
- Secco il campione fino a 11 microlitri con precisione in un Speedvac senza calore. Togliere 1 ml di campione e misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop.
- Infine, identificare i prodotti genici arricchito usando il AnalyzerIIe Illumina genoma come descritto in http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/ 2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf 6.
7. Rappresentante Risultati
Figura 1. L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di identificare bersagli genomici di KDM5A/JARID1A/RBP2 demetilasi istoni.
(P1) Questo risultato è ottenuto dalla preparazione di cross-linked cromatina che è sonicato per la produzione di frammenti di DNA di dimensioni adeguate. (P2) In una seconda fase, RBP2 frammenti di DNA legato RBP2 sono immunoprecipitati con anticorpi. (P3) Successivamente, i frammenti di DNA recuperato vengono riparati alle estremità e gli adattatori sono legatura alle estremità del DNA genomico per preparare librerie di DNA genomico per l'analisi sulle cellule del flusso nella stazione Cluster Illumina. Le librerie di DNA sono amplificati mediante PCR utilizzando basso numero di cicli. (P4), infine, illumina in sequenza breve legge sono unicamente allineati al genoma umano, picchi significativi sono identificati e annotati al più vicino geni in modo da identificare RBP2 regioni arricchito. (P5) i risultati sono ottenuti che mostrano le funzioni molecolari associati RBP2 geni bersaglio sulla base genoma identificazione di RBP2 regioni arricchito.
Figura 2. Verifica dei risultati di sonicazione cromatina Per controllare le dimensioni dei frammenti di DNA prodotti dalla procedura di sonicazione, 5 mg (1 / 10) del campione in ingresso purificato è stato caricato su gel di agarosio 1,8%. Come previsto, la nostra procedura di sonicazione prodotta frammenti nel range di 150-350 bp. Tuttavia, se i frammenti non rientrano in questo intervallo, la procedura di sonicazione deve essere adeguato di conseguenza, variando il numero di scoppi e l'ampiezza.
Figura 3. Purificazione gel di prodotti amplificati. I prodotti della PCR vengono eseguiti su un gel per rimuovere gli adattatori e selezionare un intervallo di dimensioni di template per la piattaforma generazione cluster. Questo gel mostra che i frammenti nel range tra 150 e 350 paia di basi sono state prodotte. Essi rappresentano frammenti di DNA genomico tra 50 e 250 paia di basi di lunghezza e un adattatore. Noi accise della regione selezionata del gel con un bisturi. Si deve prestare attenzione per evitare l'adattatore adattatore fascia, che corre a circa 120 paia di basi.
Figura 4. Isoforma-specifici anticorpi isoforme permette di distinguere tra grandi e piccoli di RBP2. RBP2 struttura della proteina è presentata in vista del dominio. RBP2 contiene numerosi domini: il catalizzatore degli istoni demetilazione JmjC dominio e associati JmjN dominio, un dominio ARIDE capace di sequenza-specifico legame con il DNA, un dito di zinco C5HC2 che potenzialmente possono interagire con il DNA o di altre proteine, e più domini PHD. I due anti-RBP2 anticorpi che permettono di distinguere tra RBP2 isoforme sono stati ottenuti contro i RBP2 frammenti indicata da linee spesse.
Figura 5 bis. Panoramica delle regioni RBP2 vincolante insieme dei cromosomi e geni Ensembl. Coordinate genomiche dei identificato arricchito RBP2 (tutte le isoforme e isoforma grandi) le regioni vincolanti sono presentati cromosoma saggio. Occupances di geni Ensembl (versione 54; hg18) nei cromosomi (cromosoma 10 in questa foto) si presentano come bande nere (pannello superiore). Ogni regione RBP2 legame è rappresentato come una linea verticale, in cui il pannello centrale mostra tutte le isoforme RBP2 regioni vincolante sul cromosoma 10, e il pannello inferiore mostra RBP2 regioni isoforma grandi vincolanti. La parte centrale e dei pannelli in basso danno panoramica di sovrapposizione e di occupazione specifico di RBP2 isoforme sul cromosoma 10.
Figura 5b. Analisi di arricchimento funzionale di RBP2 geni bersaglio. Heatmap mostrando FDR corretto in modo significativo (p-value ≤ 0,05) arricchito GO categorie Funzione molecolare tra i geni legati (più vicini i geni per la regione RBP2 vincolante) da RBP2 (isoforme tutti e grande). Colori verso il rosso indicano alto significato statistico, giallo indica scarsa importanza statistica, e grigio indica alcuna rilevanza statistica. Analisi di arricchimento mostra le funzioni specifiche sovrapposizioni e isoforma molecolare di RBP2 geni bersaglio.
Discussion
Differenze funzionali tra isoforme RBP2 non sono stati determinati. Abbiamo usato un approccio globale per identificare regioni genomiche vincolato da RBP2 isoforme e definire le categorie funzionali che queste regioni rappresentano. Ciò è stato realizzato da Chip-Seq analisi seguita da analisi bioinformatica di sequenze ottenute legge.
RBP2 modifica metilato residui di lisina in code degli istoni. Abbiamo scoperto che RBP2 isoforma grande contenente il modulo di riconoscimento per metilata dell'istone isoforma lisina e RBP2 piccoli privi di questo modulo si legano alle diverse regioni nel genoma umano (Figura 5A). Importante, isoforma-specifici e regioni sovrapposte appartengono a geni con diverse funzioni molecolare (Figura 5B). Ad esempio, "cromatina vincolante" e "fattore di trascrizione vincolante" funzioni possono essere attribuite agli obiettivi gene di RBP2 isoforma piccola ma non di RBP2 isoforma di grandi dimensioni (Figura 5B). Confrontando gene attuale set generati per tutte le isoforme e RBP2 isoforma di grandi dimensioni (dati non riportati), si può anche definire se l'isoforma di grandi dimensioni è specificamente reclutato alcuni geni.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da 115.347-RSG-08-271-01-GMC da ACS, e da CA138631 borsa di studio NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F79500 | |
| BSA | USB Corp., Affymetrix | 10852 | |
| chloroform/isoamyl alcohol | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Genomic DNA Sample Prep Kit | Illumina | FC-102-1001 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| glycogen | Boehringer Ingeheim | 901393 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250-500 | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | |
| Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| N-lauroyl sarcosine | MP Biomedicals | 194008 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| PBS | Fisher Scientific | mt21040cv | |
| phenol | Sigma-Aldrich | P-4557 | |
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | F-540S | |
| proteinase K | GIBCO, by Life Technologies | 25530-049 | |
| QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| MinElute PCR purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| RNAse A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| SDS | Invitrogen | 24730020 | |
| TE (endofree for maxi-prep kit) | Qiagen | 19048 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151100 | |
| Ultra Agarose, Certified low-range | Bio-Rad | 161-3106 | |
Oligonucleotide sequences 2006 Illumina, Inc. All rights reserved.
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References
- Wang, G. G. Haematopoietic malignancies caused by dysregulation of a chromatin-binding PHD finger. Nature. 459 (7248), (2009).
- Benevolenskaya, E. V. Binding of pRB to the PHD protein RBP2 promotes cellular differentiation. Mol Cell. 18 (6), 623-623 (2005).
- Lopez-Bigas, N. Genome-wide analysis of the H3K4 histone demethylase RBP2 reveals a transcriptional program controlling differentiation. Mol Cell. 31 (4), 520-520 (2008).
- Benevolenskaya, E. V. Histone H3K4 demethylases are essential in development and differentiation. Biochem Cell Biol. 85 (4), 435-435 (2007).
- Odom, D. T. Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors. Science. 303 (5662), 1378-1378 (2004).
- Guenther, M. G. Aberrant chromatin at genes encoding stem cell regulators in human mixed-lineage leukemia. Genes Dev. 22 (24), 3403-3403 (2008).
