Dubbele Fluorescentie In situ Hybridisatie in Fresh Brain secties

Summary

Dit protocol betreft een niet-radioactieve

Abstract

Hier beschrijven we een aangepaste versie van een dubbele fluorescentie

Protocol

Dit protocol is ontwikkeld en verfijnd op basis van standaard radioactief en niet-radioactieve in-situ hybridisatie methoden, die eerder door ons ontwikkelde en anderen om een of twee transcript soorten op te sporen in het hersenweefsel ^1-7. Het protocol hieronder beschreven heeft een totale lengte van 2 of 3 dagen, afhankelijk van het aantal procedurele onderbrekingen gekozen door de eindgebruiker. Alle stappen hieronder weergegeven dienen te worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, met uitzondering van de riboprobe hybridisatie stap en post-hybridisatie wast. De oplossingen en buffers die nodig zijn voor alle stappen die betrokken zijn bij deze methode is te vinden op het einde van dit protocol.

1. Tissue Voorbereiding en snijden

1. Onthoofden en snel extract onder voorbehoud van de hersenen, en plaats deze in een plastic mal van voldoende grootte.
2. Bedek hersenen met Tissue-Tek inbedding medium en snel de plastic mal plaats in een dry-ice/alcohol bad voor een snelle invriezen. Bevroren weefsel kan worden opgeslagen bij -80 ° C tot gebruik.
3. Met behulp van een cryostaat, verzamelen 2 of 3 hersenen secties per slide op betalen Superfrost Plus dia's. Dikte van de rubrieken moeten gegevens worden 10 tot 12 micrometer. Dia's kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C tot gebruik.

2. De voorbereiding van Sephadex G50 kolommen voor Probe Zuivering

"Sephadex kolommen kunnen worden gekocht uit commerciële bronnen, echter, bieden wij onder een low-cost alternatief voor het genereren van kolommen, die nodig zijn voor probe zuivering.

1. Hydraat voldoende hoeveelheid Sephadex G50 poeder met RNase-vrij, DEPC behandeld water (bijvoorbeeld 2 g poeder in 100 ml DEPC behandelde water), meng-oplossing kort en bewaar bij kamertemperatuur voor het neerslaan van overtollige Sephadex G50.
2. Verwijder de bovendrijvende (bovenste laag van het water) naar aanleiding van Sephadex G50 neerslag.
3. Herhaal het proces boven de 3 - 5 keer.
4. Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de Sephadex G50-oplossing in TE-buffer (1:1-verhouding), en bewaar bij 4 ° C tot gebruik.
5. Plaats geautoclaveerd glaswol in een steriele 1 ml spuit en deze comprimeren met de zuiger om een ​​compacte laag op de bodem te maken, en vervolgens de spuit te plaatsen in een 15 ml Falcon buis.
6. Meng goed de oplossing van Sephadex G50 in TE. Vul de spuit / kolom met deze oplossing.
7. Centrifugeer de kolom gedurende 30 seconden bij 1000 tpm.
8. Herhaal deze procedure tot de kolom is bijna volledig gevuld met Sephadex G50 kralen.
9. Van toepassing zijn 200 ul van kolom wasbuffer de kolom en centrifugeer het voor 2 min bij 1000 rpm. Gooi flow-through.
10. Van toepassing zijn 200 ul van kolom blokkeerbuffer de kolom en spin het voor 2 min bij 1000 rpm. Herhaal deze stap 4-5 keer naar kolom evenwicht. Kolommen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C tot gebruik als afgesloten met Parafilm.

3. Etikettering en de zuivering van riboprobes

Hieronder geven we detail het genereren en zuivering van een enkele riboprobe. Voor dFISH, zal de voorbereiding van elke probe te betrekken dezelfde methode, behalve dat een van de probes zal gelabeld worden met digoxigenine (DIG)-tagged UTP terwijl de andere met biotine-gelabeld UTP.

1. Maak een geconcentreerde (> 150 ng / ul) en gezuiverd gelineariseerde cDNA-oplossing van belang is voor zowel zin (controle) of antisense riboprobes genereren.
2. In een 1,5 ml microfugebuisje, voeg 0,5-1 ug van gezuiverd cDNA template, 2 pi van 5x sonde etikettering buffer, 1 ui 10X DIG (of biotine)-labeling mix, 0,5 pi RNasin en 1 ul van de juiste RNA-polymerase , en breng het uiteindelijke volume van de oplossing tot 10 ul met RNAse-vrij (DEPC behandeld) water.
3. Incubeer de oplossing in een waterbad bij 37 ° C gedurende 2 uur.
4. Voeg 1 ui van tRNA (materieel; 20 pg / pl), en 39 ul van kolom blokkeerbuffer aan de oplossing.
5. Bereid de Sephadex G50 kolom voor probe zuivering. Te dien einde, voeg 50 ul blokkeerbuffer de kolom en spin deze voor 10 sec bij 1000 tpm.
   Herhaal deze stap 2-3 keer naar de kolom (dat wil zeggen, de volle 50 ul aangebracht op de kolom worden teruggewonnen na de cyclus van centrifugeren) evenwicht.
6. Breng de sonde oplossing voor de Sephadex G50 kolom, de positie van een nieuwe microfugebuis aan de onderkant van de kolom, en spin het voor 3 min bij 1000 rpm de gezuiverde 50 ul van riboprobe oplossing te verkrijgen.
7. Beoordeel de kwaliteit en opbrengst van gelabelde riboprobe met behulp van een standaard-formaldehyde-agarose RNA-gel, of een spectrofotometer.

4. Post-fixatie, acetylering en hybridisatie

1. Verwijder secties van de -80 ° C vriezer en zorgen voor een kamertemperatuur van het evenwicht. Vervolgens incuberen secties in een koud, vers gemaakte 3% paraformaldehyde-oplossing gedurende 5 minuten.
2. Kort spoelen secties in phosphate gebufferde zoutoplossing (PBS) twee keer.
3. Uitdrogen delen via een standaard alcohol-serie (70, 95, en 100%, 2 minuten elk), en laat ze drogen aan de lucht.
4. Incubeer afdelingen in een acetylering oplossing gedurende 10 minuten.
5. Spoel secties 3 keer in 2X SSPE.
6. Uitdrogen secties opnieuw via de standaard alcohol-serie hierboven beschreven, en laat ze aan de lucht drogen.
7. Bereid een voldoende volume van de hybridisatie-oplossing en voeg beide riboprobes aan de oplossing (probe concentratie: 1 ng / ul voor elke probe). Totale volume van de hybridisatie-oplossing wordt bepaald op basis van het aantal secties worden gehybridiseerd (16 ul van hybridisatie-oplossing per sectie).
8. Van toepassing zijn voldoende volume van de hybridisatie-oplossing om weefsel en dekglaasje dia's ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen overlay het weefsel.
9. Plaats de glaasjes in een metalen houder. Dompel de houder in een minerale olie bad op 65 ° C gedurende de nacht. Zorg ervoor dat coverslips naar boven gericht zijn (dat wil zeggen, de laterale aspect van de dia houder moet in contact komen met de bodem van de minerale olie container).

5. Post-hybridisatie Wast

1. De volgende dag, verwijder voorzichtig de diahouder van de minerale olie bad en spoel het kort in chloroform om overtollige olie te verwijderen uit de dia's.
2. Plaats de glaasjes in een 2X SSPE oplossing voor 5-10 minuten. Dekglaasjes moeten los te maken van dia's, terwijl in oplossing.
3. Overdracht van de dia's om een ​​nieuw 2X SSPE-oplossing, en bewaar ze voor 1 uur bij kamertemperatuur.
4. Transfer secties in een oplossing met 2X SSPE plus 50% formamide. De temperatuur van deze oplossing moet overeenkomen met de temperatuur die in de nacht hybridisatie procedure. Houden dia's in deze oplossing voor de 1,5 uur.
5. Overdracht sectie om een ​​0.1X SSPE-oplossing voorverwarmd tot dezelfde temperatuur van de hybridisatie stap. Incubeer secties in deze oplossing gedurende 30 minuten. Herhaal deze stap voor een extra 30 minuten.

6. Detectie en visualisatie van riboprobes

1. Overdracht dia's aan TNT buffer waaraan 0,3% waterstofperoxide is toegevoegd, gedurende 10 minuten.
2. Was secties in TNT buffer, 3 keer (10 minuten).
3. Met behulp van een DAKO pen, trek een goed rond het gebied met de hersenen secties. Belangrijk is, moet voorzichtigheid worden betracht om ervoor te zorgen dat de onderdelen niet droog.
4. Van toepassing zijn 150 ul van TNB buffer aan elke dia, en incubeer secties in deze oplossing gedurende 30 min, in een vochtige kamer.
5. Verwijder het teveel TNB oplossing door het kantelen van dia's.
6. Van toepassing zijn 150 ul van TNB oplossing met peroxidase-geconjugeerd anti-DIG antilichaam, en op te slaan dia's in een vochtige kamer voor 2 uur. Antilichaamconcentratie moet individueel worden bepaald voor elk transcript van belang voorafgaand aan het uitvoeren van dFISH.
7. Was secties in TNT buffer, 3 keer, 10 minuten per stuk.
8. Van toepassing zijn 150 ul van Alexa 594-geconjugeerde tyramide werkende oplossing voor elke dia, en bewaar ze in een vochtige kamer gedurende 1 uur. Deze oplossing moet worden bereid volgens de aanwijzingen van de fabrikant.
9. Was secties in TNT buffer, 3 keer, 10 minuten per stuk.
10. Incubeer secties in TNT buffer om die 0,3% waterstofperoxide is toegevoegd voor 10 - 30 minuten.
11. Was secties in TNT buffer, 3 keer, 10 minuten per stuk.
12. Van toepassing zijn 150 ul van TNB buffer per dia, en bewaar ze in een vochtige kamer gedurende 30 minuten.
13. Verwijder het teveel TNB oplossing door het kantelen van dia's.
14. Voeg 150 ul van TNB oplossing met peroxidase-geconjugeerd anti-biotine antilichaam, en op te slaan dia's in een vochtige kamer voor 2 uur.
15. Was secties in TNT buffer, 3 keer, 10 minuten per stuk.
16. Van toepassing zijn 150 ul van een Alexa 488-geconjugeerde tyramide werkende oplossing om de dia's en incubeer secties voor 1 uur. Deze oplossing moet worden bereid volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
17. Was secties in TNT buffer, 3 keer, 10 minuten per stuk.
18. Voeg 150 ul van Hoechst-oplossing (1:1000 in TNT buffer) aan de secties en bewaar ze in de vochtige kamer gedurende 2 minuten.
19. Was de secties in TNT buffer, 3 keer, 5 min per stuk.
20. Dekglaasje secties met een fluorescentie-compatibele montage medium (bv. Vectashield of verlengen antifade).

7. Representatieve resultaten

Figuur 1. We laten hier vertegenwoordiger dFISH resultaten van de zebravink hersenen. Getoond zijn microfoto verkregen uit de caudomedial nidopallium (NCM), de zangvogel analogon van de zoogdieren auditieve cortex. Brain secties werden gehybridiseerd met een gebiotinyleerde riboprobe gericht tegen parvalbumin (A), een marker voor een subpopulatie van de remmende neuronen, en een DIG-gelabelde riboflaprobe gericht tegen de activiteit-afhankelijke gen Zenk (B), een betrouwbare marker voor lied-driven neuronen. C) Overlay van (A) en (B) toont een populatie van remmende neuronen die worden geactiveerd door auditieve ervaring. Pijlen en pijlpunten geven aan cellen uitsluitend gelabeld met elk van de twee riboprobes, en sterretjes zien vertegenwoordiger van neuronen die co-expressie beide transcripties van belang. Schaalbalk = 25 pm.

Discussion

Wij hebben gebruik gemaakt van dit protocol te onderzoeken hoe de gewervelde hersenen neurochemisch en functioneel georganiseerd, en hoe gedragsmatig-relevante zintuiglijke prikkels invloed hebben op de genomische machinerie van neuronen in het volwassen brein ^80-10 te bepalen. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze methode in hersenweefsel van muizen, ratten en zangvogels, maar verwachten dat dit protocol zal worden eenvoudig aan te passen aan de hersenen verkregen na een reeks van gewervelde soorten en, misschien, niet-neurale weefsels. Key controls nodig zijn om het verkrijgen van betrouwbare resultaten en een optimale signaal zijn uitvoerig uitgewerkt door onze groep ergens anders ^{11, 12.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC	VWR international	IC15090225	toxic substance
PCR purification kit	Qiagen	28104
Formaldehyde	VWR international	BDH0506-4LP	toxic substance
T3 RNA polymerase	Roche Group	11031163001
T7 RNA polymerase	Roche Group	10881767001
Tris-HCl (1 M, pH 7.5)	VWR international	IC816124
MgCl2 (1 M)	Sigma-Aldrich	449172
Spermidine (1 M)	Sigma-Aldrich	S0266
DIG RNA labeling mix	Roche Group	NC9380805
Biotin RNA labeling mix	Roche Group	NC9440104
RNasin	Promega Corp.	N2111
BSA	Sigma-Aldrich	05491
DTT	Sigma-Aldrich	D5545
Sephadex G50	VWR international	95016-772
EDTA	VWR international	101384-758
SDS	Sigma-Aldrich	L4390
Transfer (t)RNA	Invitrogen	15401011
10X MOPS	VWR international	14221-398	toxic substance
Paraformaldehyde	VWR international	AAAL04737-36	toxic substance
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S3139
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S3264
NaOH	VWR international	SX0600-1
Triethanolamine	VWR international	IC15216391
Acetic anhydride	VWR international	MK242002	toxic substance
SSPE	VWR international	82021-488
Formamide	VWR international	JT4028-1	toxic substance
Poly A	Invitrogen	POLYA.GF
Mineral oil	VWR international	IC15169491
Chloroform	VWR international	BDH1109	organic solvent
Deionized formamide	Sigma-Aldrich	F9037	toxic substance
Hydrogen peroxide	VWR international	VW36901	toxic substance
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Triton X-100	JT Baker	X198-05
Anti-DIG HRP	Roche Group	11093274910
Anti-biotin peroxidase	Vector Laboratories	SP3010
TSA Alexa Fluor 594	Invitrogen	T20935
TSA Alexa Fluor 488	Invitrogen	T20932
H–chst	VWR international	200025-538
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
embedding mold	VWR international	15160-157
cryostat	Leica Microsystems	CM 1850
Superfrost plus slide	VWR international	89033-052
Solutions Column washing buffer: 10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05 mM EDTA, 50 μg/μl tRNA, 0.1% SDS in 50 ml DEPC-treated water. Column blocking buffer: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA in 50 ml DEPC-treated water. TNT buffer: 60 ml of 1 M Tris-HCl, 18 ml of 5 M NaCl and 1.8 ml of Triton X-100 in 600 ml of DEPC-treated water. TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8.3 μg/μl BSA, 0.15 M NaCl and 3% Triton X-100 in DEPC-treated water. TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 plus 1 mM EDTA, pH 7.5. Acetylation solution: 2.7 ml of triethanolamine plus 0.5 ml of acetic anhydride in 200 ml of DEPC-treated water. Hybridization solution: 50% formamide, 2X SSPE, 2 μg/μl tRNA, 1 μg/μl BSA and 1 μg/μl poly A in DEPC-treated water. It needs 16 l per section.