Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten

Published: August 14, 2010 doi: 10.3791/2102
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Brain and Cognitive Sciences, University of Rochester, 2Center for Visual Science, University of Rochester

Summary

Dieses Protokoll umfasst eine nicht-radioaktive

Abstract

Hier beschreiben wir eine modifizierte Version des Doppel-Fluoreszenz-

Protocol

Dieses Protokoll wurde entwickelt und basiert auf Standard-radioaktive und nicht-radioaktiven in-situ-Hybridisierung Methoden, die zuvor von uns und anderen entwickelt wurde, um ein oder zwei Transkript Arten in Hirngewebe 1-7 erkennen verfeinert. Die unten beschriebenen Protokoll hat eine Gesamtlänge von 2 oder 3 Tage, je nach der Anzahl der prozeduralen Unterbrechungen durch den Endbenutzer gewählt. Alle Schritte nachfolgend beschrieben werden, um bei Raumtemperatur durchgeführt werden, mit Ausnahme der Ribosonde Hybridisierung und post-Hybridisierung wäscht. Die Lösungen und Puffer für alle Schritte in diesem Verfahren Beteiligten erforderlich finden Sie am Ende dieses Protokoll gefunden werden.

1. Tissue Vorbereitung und Schnitte

  1. Enthaupten und extrahieren Thema Gehirn schnell ab, und legen Sie sie in eine Kunststoff-Formenbau von ausreichender Größe.
  2. Cover Gehirn mit Tissue-Tek Einbettmedium und schnell statt der Kunststoff-Form in einem dry-ice/alcohol Bad für schnelles Einfrieren. Gefrorenes Gewebe kann bei -80 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
  3. Mit einem Kryostaten, sammeln 2 oder 3 Hirnschnitten pro Folie auf Rechnung Superfrost Plus Objektträger. Die Dicke der Abschnitte sollten 10-12 um betragen. Dias können bei -80 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.

2. Vorbereitung der Sephadex G50 Säulen für Probe Purification

"Sephadex-Säulen aus kommerziellen Quellen erworben werden kann, jedoch bieten wir Ihnen nachfolgend eine kostengünstige Alternative für die Erzeugung von Spalten, die für die Sonde Reinigung benötigt werden.

  1. Hydrate ausreichende Menge an Sephadex G50-Pulver mit RNase-freiem, DEPC-behandeltem Wasser (z. B. 2 g Pulver in 100 ml DEPC-behandeltem Wasser), Mix-Lösung kurz und bei Raumtemperatur lagern, um Niederschlag über Sephadex G50.
  2. Überstand entfernen (obere Schicht des Wassers) nach Sephadex G50 Niederschlag.
  3. Wiederholen Sie den Vorgang über 3 bis 5 mal.
  4. Nach dem letzten Waschen, wieder aussetzen Sephadex G50-Lösung in TE-Puffer (1:1), und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung.
  5. Legen Sie autoklaviert Glaswolle in eine sterile 1 ml-Spritze und komprimiert sie mit dem Stößel zu einer kompakten Schicht an der Unterseite machen, und dann legen Sie die Spritze in eine 15 ml Falcon-Röhrchen.
  6. Gut mischen die Lösung von Sephadex G50 in TE. Füllen Sie die Spritze / Spalte mit dieser Lösung.
  7. Zentrifugieren Sie die Spalte für 30 sec bei 1000 Umdrehungen pro Minute.
  8. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Spalte ist fast vollständig mit Sephadex G50 Perlen gefüllt.
  9. Apply 200 pl Säule Waschpuffer auf die Säule und zentrifugieren Sie für 2 min bei 1000 Umdrehungen pro Minute. Durchfluss verwerfen.
  10. Apply 200 pl Säule Blocking-Puffer in die Säule und spinnen sie für 2 min bei 1000 Umdrehungen pro Minute. Wiederholen Sie diesen Schritt 4-5 mal in die Spalte Gleichgewicht zu bringen. Spalten können bei 4 ° C gelagert werden, bis zu verwenden, wenn mit Parafilm abgedichtet.

3. Beschriftung und Reinigung von Ribosonden

Im Folgenden ausführlich die Erzeugung und Reinigung eines einzelnen Ribosonde. Für dFISH, wird die Vorbereitung der einzelnen Sonde beinhalten die gleiche Methode, außer dass einer der Sonden mit Digoxigenin (DIG)-markierten UTP, während die anderen werden mit Biotin-markierten UTP markiert.

  1. Bereiten Sie eine konzentrierte (> 150 ng / ul) und gereinigtes linearisierten cDNA-Lösung von Interesse, um entweder (Kontrolle) oder antisense Ribosonden generieren.
  2. In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, fügen 0,5-1 pg gereinigte cDNA-Template, 2 ul 5X Sondenmarkierung Puffer, 1 ul 10x DIG (oder Biotin)-Labeling Mix, 0,5 ul RNasin und 1 ul der entsprechenden RNA-Polymerase und bringt die endgültige Volumen der Lösung auf 10 ul mit RNase-freiem (DEPC-behandelt) Wasser.
  3. Inkubieren Sie die Lösung in einem Wasserbad bei 37 ° C für 2 Stunden.
  4. Add 1 ul tRNA (Lager 20 ug / ul) und 39 ul der Spalte Blocking-Puffer in der Lösung.
  5. Bereiten Sie die Sephadex G50-Säule für die Sonde Reinigung. Zu diesem Zweck werden 50 ul Blocking-Puffer in die Säule und drehen Sie es für 10 sec bei 1000 Umdrehungen pro Minute.
    Wiederholen Sie diesen Schritt 2-3 mal auf die Säule (also die vollen 50 ul auf die Säule sind nach Zyklus der Zentrifugation gewonnen) ausgleichen.
  6. Übernehmen Sie die Sonde Lösung der Sephadex G50-Säule, Position ein neues Mikrozentrifugenröhrchen am unteren Rand der Säule, und drehen Sie es für 3 min bei 1000 rpm, um das gereinigte 50 ul Ribosonde Lösung zu erhalten.
  7. Beurteilen Sie die Qualität und Ausbeute der markierten Ribosonde entweder mit einem Standard-Formaldehyd-Agarose-RNA-Gel oder ein Spektralphotometer.

4. Post-Fixierung, Acetylierung und Hybridisierung

  1. Entfernen Sie Ausschnitte aus dem -80 ° C Gefrierschrank und ermöglichen eine Raumtemperatur ins Gleichgewicht. Anschließend inkubieren Abschnitte in einem kalten, frisch zubereitete 3% Paraformaldehyd-Lösung für 5 min.
  2. Kurz spülen Abschnitte in phosphate Kochsalzlösung (PBS) zweimal.
  3. Entwässern Schnitte durch ein Standard-Alkohol-Reihe (70, 95 und 100%; je 2 min), und lassen Sie sie an der Luft trocknen.
  4. Inkubieren Abschnitte in einer Acetylierung Lösung für 10 min.
  5. Spülen Sie den Abschnitten 3 mal in 2X SSPE.
  6. Entwässern Abschnitte noch einmal durch die Standard-Alkohol-Reihe oben beschrieben, und es ihnen an der Luft trocknen.
  7. Bereiten Sie ein angemessenes Volumen der Hybridisierungslösung und fügen Sie beide Ribosonden die Lösung (Sonde Konzentration: 1 ng / ul für jede Sonde). Das Gesamtvolumen der Hybridisierungslösung wird auf der Grundlage der Anzahl der Abschnitte, um hybridisiert (16 ul Hybridisierungslösung pro Abschnitt) bestimmt.
  8. Bewerben ausreichendes Volumen der Hybridisierungslösung, um Gewebe und Deckglas gleitet sicher, dass keine Luftblasen Overlay das Gewebe.
  9. Die Objektträger in einem Metall Diahalter. Tauchen Halter in ein Mineral Ölbad bei 65 ° C über Nacht eingestellt. Stellen Sie sicher, dass Deckgläser sind nach oben gerichtet (dh der lateralen Seite des Diahalter sollten in Kontakt mit dem Boden des Mineralöl-Container werden).

5. Post-Hybridisierung Wäscht

  1. Am folgenden Tag, entfernen Sie vorsichtig den Diahalter aus der Mineralöl-Bad und kurz ausspülen in Chloroform, um überschüssiges Öl von den Folien zu entfernen.
  2. Die Objektträger in einem 2X SSPE-Lösung für 5-10 min. Deckgläser sollten von Dias, während in Lösung zu lösen.
  3. Die Objektträger in eine neue 2X SSPE-Lösung, und halten Sie sie für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
  4. Transfer-Abschnitte in einer Lösung mit 2X SSPE plus 50% Formamid. Die Temperatur dieser Lösung sollte mit der Temperatur in der Nacht Hybridisierung Verfahren verwendet. Halten Sie Folien in dieser Lösung für 1,5 Stunden.
  5. Transfer-Abschnitte, um eine 0,1 × SSPE-Lösung auf die gleiche Temperatur der Hybridisierung vorgewärmt. Inkubieren Abschnitte in dieser Lösung für 30 min. Wiederholen Sie diesen Schritt für weitere 30 min.

6. Erkennung und Visualisierung von Ribosonden

  1. Transfer-Folien TNT-Puffer, dem 0,3% Wasserstoffperoxid wurde hinzugefügt, für 10 min.
  2. Wash Abschnitte in TNT-Puffer, 3-mal (10 Min.).
  3. Mit einem DAKO Pen zeichnen ein gut in die Umgebung mit den Hirnschnitten. Wichtig ist, ist Vorsicht geboten, um sicherzustellen, dass Teile nicht trocken werden.
  4. Apply 150 ul TNB-Puffer zu jedem Dia, und inkubieren Abschnitte in dieser Lösung für 30 min in einer feuchten Kammer.
  5. Entfernen Sie überschüssiges TNB Lösung durch Kippen Dias.
  6. Apply 150 ul TNB Lösung mit Peroxidase-konjugierten anti-DIG-Antikörper, und speichern Sie gleitet in einer feuchten Kammer für 2 Stunden. Antikörper-Konzentration sollte individuell für jedes Transkript von Interesse vor der Durchführung dFISH bestimmt werden.
  7. Wash Abschnitte in TNT-Puffer, 3-mal, jeweils 10 Minuten.
  8. Apply 150 ul Alexa 594-konjugierten Tyramid funktionierende Lösung zu jeder Folie, und speichern sie in einer feuchten Kammer für 1 Stunde. Diese Lösung muss nach den Anweisungen des Herstellers zubereitet werden.
  9. Wash Abschnitte in TNT-Puffer, 3-mal, jeweils 10 Minuten.
  10. 30 min - inkubieren Abschnitte in TNT-Puffer, dem 0,3% Wasserstoffperoxid für 10 aufgenommen worden.
  11. Wash Abschnitte in TNT-Puffer, 3-mal, jeweils 10 Minuten.
  12. Apply 150 ul TNB-Puffer pro Objektträger, und bewahren Sie sie in einer feuchten Kammer für 30 min.
  13. Entfernen Sie überschüssiges TNB Lösung durch Kippen Dias.
  14. Add 150 ul TNB Lösung mit Peroxidase-konjugierten anti-Biotin-Antikörper, und speichern Sie gleitet in einer feuchten Kammer für 2 Stunden.
  15. Wash Abschnitte in TNT-Puffer, 3-mal, jeweils 10 Minuten.
  16. Apply 150 pl einer Alexa 488-konjugierten Tyramid funktionierende Lösung, um die Folien und inkubieren Abschnitte für 1 Stunde. Diese Lösung sollte nach den Empfehlungen des Herstellers vorbereitet werden.
  17. Wash Abschnitte in TNT-Puffer, 3-mal, jeweils 10 Minuten.
  18. Add 150 ul Hoechst-Lösung (1:1000 in TNT-Puffer) zu den Abschnitten und halten sie in der feuchten Kammer für 2 min.
  19. Waschen Sie die Abschnitte in TNT-Puffer, 3-mal, jeweils 5 min.
  20. Deckglas Abschnitte mit einem Fluoreszenz-kompatible Mounting Medium (zB Vectashield oder verlängern Antifade).

7. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1
Abbildung 1. Wir zeigen hier Vertreter dFISH Ergebnisse in der Zebrafinken Gehirn erhalten. Gezeigt werden Aufnahmen aus dem caudomedial nidopallium (NCM), der Singvogel Analogon des auditorischen Kortex von Säugetieren erhalten. Gehirn-Schnitte wurden mit einem biotinylierten Ribosonde gegen Parvalbumin (A), ein Marker für eine Subpopulation der hemmenden Neuronen gerichtet hybridisiert und einer DIG-markierten RiboSonde gegen die Aktivitäts-abhängigen Gen Zenk (B), ein zuverlässiger Marker für Song-driven Neuronen gerichtet. C) Überlagerung von (A) und (B) zeigt eine Bevölkerung von hemmenden Neuronen, die durch Hörerlebnis aktiviert werden. Pfeile und Pfeilspitzen zeigen Zellen ausschließlich mit jeder der beiden Ribosonden beschriftet und Sternchen zeigen repräsentative Neuronen co-exprimierenden beide Transkripte von Interesse. Balken = 25 um.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Wir haben dieses Protokoll verwendet, um zu untersuchen, wie Gehirn der Wirbeltiere neurochemisch und funktional organisiert ist, und um festzustellen, wie verhaltensgestörte relevanten sensorischen Reizen Auswirkungen der genomischen Maschinerie der Nervenzellen im erwachsenen Gehirn 8-10. Wir haben erfolgreich diese Methode in Hirngewebe von Mäusen, Ratten und Singvögel, aber erwarten, dass dieses Protokoll wird einfach an Hirnschnitten aus einem Array von Wirbeltierarten und, vielleicht, nicht-neuralen Geweben erhalten. Key steuert erforderlich, um zuverlässige Ergebnisse und optimale Signalübertragung wurden ausgiebig von unserer Gruppe an anderer Stelle 11, 12 detailliert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Arbeit unterstützt durch Zuschüsse der NIH / NIDCD und der Schmitt-Stiftung zur RP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DEPC VWR international IC15090225 toxic substance
PCR purification kit Qiagen 28104
Formaldehyde VWR international BDH0506-4LP toxic substance
T3 RNA polymerase Roche Group 11031163001
T7 RNA polymerase Roche Group 10881767001
Tris-HCl (1 M, pH 7.5) VWR international IC816124
MgCl2 (1 M) Sigma-Aldrich 449172
Spermidine (1 M) Sigma-Aldrich S0266
DIG RNA labeling mix Roche Group NC9380805
Biotin RNA labeling mix Roche Group NC9440104
RNasin Promega Corp. N2111
BSA Sigma-Aldrich 05491
DTT Sigma-Aldrich D5545
Sephadex G50 VWR international 95016-772
EDTA VWR international 101384-758
SDS Sigma-Aldrich L4390
Transfer (t)RNA Invitrogen 15401011
10X MOPS VWR international 14221-398 toxic substance
Paraformaldehyde VWR international AAAL04737-36 toxic substance
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S3139
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S3264
NaOH VWR international SX0600-1
Triethanolamine VWR international IC15216391
Acetic anhydride VWR international MK242002 toxic substance
SSPE VWR international 82021-488
Formamide VWR international JT4028-1 toxic substance
Poly A Invitrogen POLYA.GF
Mineral oil VWR international IC15169491
Chloroform VWR international BDH1109 organic solvent
Deionized formamide Sigma-Aldrich F9037 toxic substance
Hydrogen peroxide VWR international VW36901 toxic substance
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Triton X-100 JT Baker X198-05
Anti-DIG HRP Roche Group 11093274910
Anti-biotin peroxidase Vector Laboratories SP3010
TSA Alexa Fluor 594 Invitrogen T20935
TSA Alexa Fluor 488 Invitrogen T20932
H–chst VWR international 200025-538
Vectashield Vector Laboratories H-1000
embedding mold VWR international 15160-157
cryostat Leica Microsystems CM 1850
Superfrost plus slide VWR international 89033-052

Solutions

  1. Column washing buffer: 10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05 mM EDTA, 50 μg/μl tRNA, 0.1% SDS in 50 ml DEPC-treated water.
  2. Column blocking buffer: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA in 50 ml DEPC-treated water.
  3. TNT buffer: 60 ml of 1 M Tris-HCl, 18 ml of 5 M NaCl and 1.8 ml of Triton X-100 in 600 ml of DEPC-treated water.
  4. TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8.3 μg/μl BSA, 0.15 M NaCl and 3% Triton X-100 in DEPC-treated water.
  5. TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 plus 1 mM EDTA, pH 7.5.
  6. Acetylation solution: 2.7 ml of triethanolamine plus 0.5 ml of acetic anhydride in 200 ml of DEPC-treated water.
  7. Hybridization solution: 50% formamide, 2X SSPE, 2 μg/μl tRNA, 1 μg/μl BSA and 1 μg/μl poly A in DEPC-treated water. It needs 16 l per section.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jin, L., Lloyd, R. V. In situ hybridization: methods and applications. J Clin Lab Anal. 11, 2-9 (1997).
  2. Stoler, M. H. In situ hybridization. Clin Lab Med. 10, 215-236 (1990).
  3. Komminoth, P., Werner, M. Target and signal amplification: approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization. Histochem Cell Biol. 108, 325-3233 (1997).
  4. Kessler, C. The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology--a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system. Mol Cell Probes. 5, 161-205 (1991).
  5. Panoskaltsis-Mortari, A., Bucy, R. P. In situ hybridization with digoxigenin-labeled RNA probes: facts and artifacts. Biotechniques. 18, 300-307 (1995).
  6. Qian, X., Lloyd, R. V. Recent developments in signal amplification methods for in situ hybridization. Diagn Mol Pathol. 12, 1-13 (2003).
  7. Mello, C. V., Jarvis, E. D., Denisenko, N., Rivas, M. Isolation of song-regulated genes in the brain of songbirds. Methods Mol Biol. 85, 205-217 (1997).
  8. Pinaud, R. GABAergic neurons participate in the brain's response to birdsong auditory stimulation. Eur J Neurosci. 20, 1318-1330 (2004).
  9. Velho, T. A., Pinaud, R., Rodrigues, P. V., Mello, C. V. Co-induction of activity-dependent genes in songbirds. Eur J Neurosci. 22, 1667-1678 (2005).
  10. Tremere, L. A., Jeong, J. K., Pinaud, R. Estradiol shapes auditory processing in the adult brain by regulating inhibitory transmission and plasticity-associated gene expression. J Neurosci. 29, 5949-5963 (2009).
  11. Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization. Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).
  12. Pinaud, R., Jeong, J. K. Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol. 611, 115-129 (2010).

Tags

Neuroscience Ausgabe 42 Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Doppel-FISH (dFISH) Digoxigenin Biotin nicht-radioaktive Ribosonden Wirbeltieren Gehirn
Doppel-Fluoreszenz-<em> In situ</em> Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jeong, J. K., Chen, Z., Tremere, L.… More

Jeong, J. K., Chen, Z., Tremere, L. A., Pinaud, R. Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections. J. Vis. Exp. (42), e2102, doi:10.3791/2102 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter