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Neuroscience

डबल प्रतिदीप्ति बगल में संकरण

Published: August 14, 2010 doi: 10.3791/2102
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Brain and Cognitive Sciences, University of Rochester, 2Center for Visual Science, University of Rochester

Summary

इस प्रोटोकॉल के एक गैर रेडियोधर्मी शामिल

Abstract

यहाँ हम एक डबल प्रतिदीप्ति का एक संशोधित संस्करण का वर्णन

Protocol

यह प्रोटोकॉल विकसित किया गया था और मानक रेडियोधर्मी और गैर रेडियोधर्मी में स्वस्थानी संकरण विधियों, पहले हमें और दूसरों के द्वारा विकसित मस्तिष्क ऊतक 1-7 में एक या दो प्रतिलेख प्रजातियों का पता लगाने के आधार पर परिष्कृत. नीचे वर्णित प्रोटोकॉल प्रक्रियात्मक अंत उपयोगकर्ता द्वारा चुना रुकावट की संख्या के आधार पर 2 या 3 दिन के एक कुल लंबाई है. सभी नीचे विस्तृत कदम के लिए कमरे के तापमान पर आयोजित riboprobe संकरण कदम और बाद संकरण washes के अपवाद के साथ, कर रहे हैं. इस विधि में शामिल सभी चरणों के लिए आवश्यक समाधान और buffers इस प्रोटोकॉल के अंत में पाया जा सकता है.

1. ऊतक तैयारी और सेक्शनिंग

  1. सिर काटना और विषय मस्तिष्क तेजी से निकालने, और पर्याप्त आकार के प्लास्टिक मोल्ड में जगह.
  2. मस्तिष्क ऊतक टेक एम्बेडिंग मध्यम के साथ कवर और तेजी से तेजी से ठंड के लिए एक dry-ice/alcohol स्नान में प्लास्टिक मोल्ड जगह. फ्रोजन ऊतक -80 ° उपयोग पर जब तक सी संग्रहीत किया जा सकता है है.
  3. एक cryostat का प्रयोग, चार्ज Superfrost प्लस स्लाइड्स पर 2 या 3 स्लाइड प्रति मस्तिष्क वर्गों इकट्ठा. वर्गों की मोटाई 10-12 सुक्ष्ममापी किया जाना चाहिए. -80 ° उपयोग पर जब तक सी स्लाइड्स संग्रहीत किया जा सकता है.

2. Sephadex G50 स्तंभ की जांच शुद्धीकरण के लिए तैयार

Sephadex कॉलम वाणिज्यिक स्रोतों से खरीदा जा सकता है है, तथापि, हम नीचे के स्तंभ, जो जांच शुद्धि के लिए आवश्यक हो जाएगा की पीढ़ी के लिए एक कम लागत विकल्प प्रदान.

  1. RNase मुक्त, DEPC इलाज (उदाहरण के लिए, DEPC इलाज पानी की 100 मिलीलीटर में 2 ग्राम पाउडर के) पानी, मिश्रण समाधान संक्षिप्त और कमरे के तापमान पर स्टोर के साथ हाइड्रेट Sephadex G50 पाउडर की पर्याप्त राशि के अतिरिक्त G50 Sephadex वेग.
  2. सतह पर तैरनेवाला Sephadex वर्षण निम्नलिखित G50 (पानी की ऊपरी परत) निकालें.
  3. दोहराएँ उपरोक्त प्रक्रिया 5 बार - 3.
  4. अंतिम धोने के बाद, उपयोग ते बफर (1:1 अनुपात) में G50 Sephadex के समाधान है, और दुकान 4 बजे ° C तक फिर से निलंबित.
  5. जगह एक बाँझ 1 मिलीलीटर सिरिंज में कांच ऊन autoclaved और यह तल पर एक कॉम्पैक्ट परत बनाने गोताख़ोर के साथ सेक, और फिर एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में सिरिंज जगह.
  6. अच्छी तरह से ते में Sephadex G50 के समाधान मिक्स. इस समाधान के साथ सिरिंज / स्तंभ भरें.
  7. 1000 rpm पर 30 सेकंड के लिए स्तंभ अपकेंद्रित्र.
  8. इस प्रक्रिया को दोहराएँ जब तक स्तंभ लगभग पूरी तरह से Sephadex G50 मोती के साथ भरा है.
  9. स्तंभ स्तंभ धोने बफर के 200 μl लागू करें और यह 1000 rpm पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
  10. स्तंभ स्तंभ अवरुद्ध बफर के 200 μl लागू करें और यह 1000 rpm पर 2 मिनट के लिए स्पिन. इस कदम 4-5 बार दोहराएँ स्तंभ संतुलित है. स्तंभ 4 में संग्रहीत किया जा सकता है है, डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक Parafilm के साथ सील अगर.

3. लेबलिंग और Riboprobes के शोधन

नीचे हम विस्तार पीढ़ी और एक एकल riboprobe की शुद्धि. DFISH के लिए, प्रत्येक जांच की तैयारी है कि जांच के digoxigenin (डीआईजी) टैग UTP जबकि अन्य के साथ किया जाएगा बायोटिन टैग UTP के साथ लेबल को छोड़कर उसी पद्धति शामिल होगी.

  1. एक केंद्रित (> 150 एनजी / μl) और शुद्ध ब्याज की linearized सीडीएनए समाधान तैयार करने के लिए या तो (नियंत्रण) भावना या antisense riboprobes उत्पन्न.
  2. एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में, सीडीएनए टेम्पलेट, 5X जांच लेबलिंग बफर के 2 μl, 10X डीआईजी के 1 μl (या बायोटिन) लेबलिंग मिश्रण, RNasin के 0.5 μl और उचित शाही सेना पोलीमरेज़ की एक μl शुद्ध 0.5-1 μg जोड़ने , और (DEPC इलाज) RNase - मुक्त पानी के साथ 10 μl समाधान के अंतिम मात्रा ले आओ.
  3. 37 में एक पानी के स्नान में समाधान ° सी 2 घंटा के लिए सेते हैं.
  4. समाधान करने के लिए, और स्तंभ अवरुद्ध बफर के 39 μl, tRNA के 1 μl (20 μg / μl शेयर) जोड़ें.
  5. जांच शुद्धि के लिए Sephadex G50 स्तंभ तैयार. यह अंत करने के लिए, स्तंभ के लिए 50 μl अवरुद्ध बफर जोड़ने और 10 सेकंड के लिए यह 1000 rpm पर स्पिन.
    इस कदम 2-3 बार दोहराएँ स्तंभ (यानी, पूरे 50 स्तंभ के लिए लागू μl centrifugation के चक्र के बाद बरामद कर रहे हैं) संतुलित.
  6. जांच Sephadex G50 स्तंभ, स्थिति स्तंभ के नीचे एक नया microfuge ट्यूब के समाधान को लागू करें, और यह 1000 rpm पर 3 मिनट के लिए स्पिन शुद्ध riboprobe समाधान के 50 μl प्राप्त है.
  7. और लेबल riboprobe की गुणवत्ता और उपज का आकलन या तो एक मानक formaldehyde-agarose आरएनए जेल, या एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग.

4. पोस्ट - निर्धारण एसिटिलीकरण, और संकरण

  1. -80 ° सी फ्रीजर से वर्गों निकालें और एक कमरे के तापमान को संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं. बाद में, एक ठंडा, हौसले किया 5 मिनट के लिए 3% paraformaldehyde समाधान में वर्गों सेते हैं.
  2. संक्षेप में पी में वर्गों कुल्लाhosphate खारा (पीबीएस) दो बार buffered.
  3. एक मानक शराब श्रृंखला (70, 95, और 100%, 2 मिनट प्रत्येक) के माध्यम से वर्गों निर्जलीकरण, और उन्हें हवा शुष्क.
  4. 10 मिनट के लिए एक एसिटिलीकरण समाधान में वर्गों को सेते हैं.
  5. 2X SSPE में 3 बार वर्गों कुल्ला.
  6. वर्गों मानक शराब श्रृंखला ऊपर वर्णित के माध्यम से एक बार फिर, निर्जलीकरण और उन्हें हवा शुष्क करने की अनुमति.
  7. संकरण समाधान की एक पर्याप्त मात्रा में तैयार और समाधान (जांच एकाग्रता: 1 / प्रत्येक जांच के लिए एनजी μl) के लिए दोनों riboprobes को जोड़ने. संकरण समाधान की कुल मात्रा (अनुभाग प्रति संकरण समाधान के 16 μl) संकरित वर्गों की संख्या के आधार पर निर्धारित किया जाता है.
  8. संकरण ऊतक और coverslip कि कोई हवाई बुलबुले उपरिशायी ऊतक स्लाइड्स सुनिश्चित करने के लिए समाधान की पर्याप्त मात्रा में लागू करें.
  9. प्लेस एक धातु स्लाइड धारक में स्लाइड. एक खनिज तेल स्नान में विसर्जित धारक 65 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर सेट है. सुनिश्चित करें coverslips कि ऊपर की ओर का सामना कर रहे हैं (यानी, स्लाइड धारक के पार्श्व पहलू खनिज तेल कंटेनर के नीचे के साथ संपर्क में होना चाहिए).

5. पोस्ट - संकरण Washes

  1. अगले दिन, ध्यान से खनिज तेल स्नान से स्लाइड धारक को हटाने और संक्षेप में यह क्लोरोफॉर्म में कुल्ला स्लाइड्स से अतिरिक्त तेल निकाल दें.
  2. 5-10 मिनट के लिए एक 2X SSPE समाधान प्लेस में स्लाइड. Coverslips जबकि समाधान में स्लाइड्स से अलग चाहिए.
  3. एक नई 2X SSPE समाधान के लिए स्लाइड्स स्थानांतरण, और उन्हें कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए रख.
  4. 2X SSPE प्लस 50% formamide युक्त समाधान में वर्गों का स्थानांतरण. इस समाधान का तापमान रातोंरात संकरण प्रक्रिया में प्रयोग किया जाता तापमान मैच चाहिए. इस समाधान में 1.5 घंटे के लिए स्लाइड्स का रखें.
  5. एक 0.1X SSPE समाधान संकरण कदम का एक ही तापमान पूर्व गरम वर्गों स्थानांतरण. 30 मिनट के लिए इस समाधान में वर्गों सेते हैं. एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए इस चरण को दोहराएँ.

6. Riboprobes की जांच विज़ुअलाइज़ेशन

  1. टीएनटी बफर स्लाइड्स स्थानांतरण जो 0.3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड 10 मिनट के लिए जोड़ा गया है,.
  2. टीएनटी बफर, 3 बार (10 मिनट प्रत्येक) में वर्गों धो लें.
  3. DAKO कलम का प्रयोग, मस्तिष्क वर्गों से युक्त के आसपास के क्षेत्र में एक अच्छी तरह से आकर्षित. महत्वपूर्ण बात है, सावधानी के लिए सुनिश्चित करें कि वर्गों सूखी नहीं करने के लिए प्रयोग किया जाना चाहिए.
  4. प्रत्येक स्लाइड के लिए TNB बफर के 150 μl लागू करना, और इस समाधान में वर्गों एक उमस भरे कक्ष में 30 मिनट के लिए सेते हैं,.
  5. झुकाव स्लाइड्स द्वारा अतिरिक्त TNB समाधान निकालें.
  6. TNB 2 घंटा के लिए एक नम कक्ष में peroxidase संयुग्मित एंटीबॉडी विरोधी डीआईजी, और दुकान स्लाइड्स युक्त समाधान के 150 μl लागू करें. एंटीबॉडी एकाग्रता बाहर dFISH ले जाने से पहले ब्याज की प्रत्येक प्रतिलिपि के लिए व्यक्तिगत रूप से निर्धारित करना चाहिए.
  7. धो टीएनटी बफर में वर्गों, 3 बार, 10 मिनट प्रत्येक.
  8. Alexa 594 संयुग्मित tyramide काम कर प्रत्येक स्लाइड के लिए समाधान के 150 μl लागू करें, और उन्हें 1 घंटे के लिए एक नम कक्ष में संग्रहीत. यह समाधान के निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार किया जाना चाहिए.
  9. धो टीएनटी बफर में वर्गों, 3 बार, 10 मिनट प्रत्येक.
  10. 30 मिनट - टीएनटी बफर में सेते वर्गों जो 0.3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड 10 के लिए जोड़ा गया है.
  11. धो टीएनटी बफर में वर्गों, 3 बार, 10 मिनट प्रत्येक.
  12. स्लाइड प्रति TNB बफर के 150 μl लागू, और उन्हें 30 मिनट के लिए एक नम कक्ष में रखना.
  13. झुकाव स्लाइड्स द्वारा अतिरिक्त TNB समाधान निकालें.
  14. TNB 2 घंटा के लिए एक नम कक्ष में peroxidase संयुग्मित एंटीबॉडी विरोधी बायोटिन, और दुकान स्लाइड्स युक्त समाधान के 150 μl जोड़ें.
  15. धो टीएनटी बफर में वर्गों, 3 बार, 10 मिनट प्रत्येक.
  16. एक Alexa के 150 μl 488 संयुग्मित tyramide काम कर स्लाइड और 1 घंटे के लिए सेते हैं वर्गों के लिए समाधान लागू. यह समाधान निर्माता की सिफारिशों के अनुसार तैयार किया जाना चाहिए.
  17. धो टीएनटी बफर में वर्गों, 3 बार, 10 मिनट प्रत्येक.
  18. वर्गों को Hoechst समाधान (टीएनटी बफर में 1:1000) के 150 μl जोड़ें और 2 मिनट के लिए नम कक्ष में उन्हें रखने.
  19. धो टीएनटी बफर में वर्गों, 3 बार, 5 मिनट प्रत्येक.
  20. एक प्रतिदीप्ति संगत बढ़ते मध्यम (जैसे, Vectashield या antifade लम्बा) के साथ Coverslip वर्गों.

7. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1
चित्रा 1 हम यहाँ प्रतिनिधि dFISH ज़ेबरा चिड़िया मस्तिष्क में प्राप्त परिणाम बताते हैं. दिखाया caudomedial (एनसीएम) nidopallium, स्तनधारी श्रवण प्रांतस्था के songbird एनालॉग से प्राप्त photomicrographs. ब्रेन वर्गों एक biotinylated parvalbumin (ए), निरोधात्मक न्यूरॉन्स की एक उप जनसंख्या के लिए एक मार्कर के खिलाफ निर्देशित riboprobe के साथ hybridized थे, और एक ribo डीआईजी लेबलजांच गतिविधि पर निर्भर जीन (बी) zenk, गीत संचालित न्यूरॉन्स के लिए एक विश्वसनीय मार्कर के खिलाफ निर्देशित है. सी) (ए) और (बी) निरोधात्मक न्यूरॉन्स कि श्रवण के अनुभव के द्वारा सक्रिय कर रहे हैं की एक आबादी से पता चलता है के ओवरले. तीर और arrowheads दो riboprobes के प्रत्येक के साथ विशेष रूप से लेबल कोशिकाओं से संकेत मिलता है, और तारांकनों प्रतिनिधि न्यूरॉन्स दिखाने के सह व्यक्त ब्याज के दोनों टेप. स्केल बार = 25 सुक्ष्ममापी.

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Discussion

हम इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है के लिए अध्ययन कैसे हड्डीवाला मस्तिष्क neurochemically और कार्यात्मक आयोजन किया जाता है, और कैसे behaviorally - प्रासंगिक संवेदी उत्तेजनाओं के प्रभाव वयस्क मस्तिष्क 8-10 में न्यूरॉन्स के जीनोमिक मशीनरी निर्धारित है. हम सफलतापूर्वक चूहों, चूहों और songbirds से मस्तिष्क के ऊतकों में इस पद्धति का उपयोग किया है, लेकिन आशा है कि इस प्रोटोकॉल मस्तिष्क हड्डीवाला प्रजातियों में से एक सरणी और, शायद, गैर तंत्रिका ऊतकों से प्राप्त वर्गों के लिए आसानी से अनुकूलनीय हो जाएगा. कुंजी विश्वसनीय परिणाम और इष्टतम संकेत प्राप्त करने के लिए आवश्यक नियंत्रण हमारे समूह में 11 कहीं और, 12 के द्वारा किया गया है बड़े पैमाने पर विस्तृत.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

NIH / NIDCD और श्मिट आरपी के लिए फाउंडेशन के अनुदान द्वारा समर्थित काम करना.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DEPC VWR international IC15090225 toxic substance
PCR purification kit Qiagen 28104
Formaldehyde VWR international BDH0506-4LP toxic substance
T3 RNA polymerase Roche Group 11031163001
T7 RNA polymerase Roche Group 10881767001
Tris-HCl (1 M, pH 7.5) VWR international IC816124
MgCl2 (1 M) Sigma-Aldrich 449172
Spermidine (1 M) Sigma-Aldrich S0266
DIG RNA labeling mix Roche Group NC9380805
Biotin RNA labeling mix Roche Group NC9440104
RNasin Promega Corp. N2111
BSA Sigma-Aldrich 05491
DTT Sigma-Aldrich D5545
Sephadex G50 VWR international 95016-772
EDTA VWR international 101384-758
SDS Sigma-Aldrich L4390
Transfer (t)RNA Invitrogen 15401011
10X MOPS VWR international 14221-398 toxic substance
Paraformaldehyde VWR international AAAL04737-36 toxic substance
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S3139
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S3264
NaOH VWR international SX0600-1
Triethanolamine VWR international IC15216391
Acetic anhydride VWR international MK242002 toxic substance
SSPE VWR international 82021-488
Formamide VWR international JT4028-1 toxic substance
Poly A Invitrogen POLYA.GF
Mineral oil VWR international IC15169491
Chloroform VWR international BDH1109 organic solvent
Deionized formamide Sigma-Aldrich F9037 toxic substance
Hydrogen peroxide VWR international VW36901 toxic substance
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Triton X-100 JT Baker X198-05
Anti-DIG HRP Roche Group 11093274910
Anti-biotin peroxidase Vector Laboratories SP3010
TSA Alexa Fluor 594 Invitrogen T20935
TSA Alexa Fluor 488 Invitrogen T20932
H–chst VWR international 200025-538
Vectashield Vector Laboratories H-1000
embedding mold VWR international 15160-157
cryostat Leica Microsystems CM 1850
Superfrost plus slide VWR international 89033-052

Solutions

  1. Column washing buffer: 10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05 mM EDTA, 50 μg/μl tRNA, 0.1% SDS in 50 ml DEPC-treated water.
  2. Column blocking buffer: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA in 50 ml DEPC-treated water.
  3. TNT buffer: 60 ml of 1 M Tris-HCl, 18 ml of 5 M NaCl and 1.8 ml of Triton X-100 in 600 ml of DEPC-treated water.
  4. TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8.3 μg/μl BSA, 0.15 M NaCl and 3% Triton X-100 in DEPC-treated water.
  5. TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 plus 1 mM EDTA, pH 7.5.
  6. Acetylation solution: 2.7 ml of triethanolamine plus 0.5 ml of acetic anhydride in 200 ml of DEPC-treated water.
  7. Hybridization solution: 50% formamide, 2X SSPE, 2 μg/μl tRNA, 1 μg/μl BSA and 1 μg/μl poly A in DEPC-treated water. It needs 16 l per section.

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References

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  12. Pinaud, R., Jeong, J. K. Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol. 611, 115-129 (2010).

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तंत्रिका विज्ञान 42 अंक प्रतिदीप्ति स्वस्थानी संकरण में (मछली) डबल मछली (dFISH) digoxigenin बायोटिन गैर रेडियोधर्मी riboprobes हड्डीवाला मस्तिष्क
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Jeong, J. K., Chen, Z., Tremere, L.… More

Jeong, J. K., Chen, Z., Tremere, L. A., Pinaud, R. Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections. J. Vis. Exp. (42), e2102, doi:10.3791/2102 (2010).

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