Fluorescência dupla In situ Hibridação nas Seções cérebro fresco

Summary

Este protocolo envolve um não-radioativo

Abstract

Aqui nós descrevemos uma versão modificada de uma dupla de fluorescência

Protocol

Este protocolo foi desenvolvido e aperfeiçoado com base no padrão radioativos e não radioativos métodos de hibridização in-situ, anteriormente desenvolvido por nós e outros para detectar uma ou duas espécies transcrição no tecido cerebral ^1-7. O protocolo descrito a seguir tem um comprimento total de 2 ou 3 dias, dependendo do número de interrupções processual escolhida pelo usuário final. Todas as etapas detalhadas abaixo devem ser realizados à temperatura ambiente, com exceção da etapa de hibridização riboprobe e pós-hibridação lavagens. As soluções e buffers exigido para todos os passos envolvidos neste método podem ser encontrados no final do presente protocolo.

1. Preparação do tecido e Seccionamento

1. Decapitar e extrair o cérebro do sujeito rapidamente, e colocá-lo em um molde de plástico de tamanho adequado.
2. Cobrir o cérebro com Tissue-Tek meio de incorporação e rapidamente coloque o molde de plástico em um banho dry-ice/alcohol para o congelamento rápido. Tecido congelado pode ser armazenado a -80 ° C até o uso.
3. Utilizando um criostato, recolher 2 ou 3 seções do cérebro por slide em Superfrost cobrado Além disso slides. Espessura das seções devem ser 10-12 mM. Lâminas podem ser armazenadas a -80 ° C até o uso.

2. Preparação de Sephadex G50 Colunas para Purificação Probe

"Colunas Sephadex podem ser adquiridos de fontes comerciais, no entanto, oferecemos a seguir uma alternativa de baixo custo para a geração de colunas, o que será necessário para a purificação da sonda.

1. Quantidade adequada de hidrato de Sephadex G50 em pó com RNase-free, água DEPC-tratados (por exemplo, 2 g de pó em 100 ml de água tratada DEPC-), brevemente solução misturar e armazenar à temperatura ambiente para precipitar o excesso Sephadex G50.
2. Remover o sobrenadante (camada superior de água), após precipitação Sephadex G50.
3. Repita o processo acima 3-5 vezes.
4. Após a lavagem final, re-suspender a Sephadex G50 solução em tampão TE (1:1), e armazenar a 4 ° C até o uso.
5. Lugar autoclavado lã de vidro para uma seringa estéril 1 ml e comprimi-lo com o êmbolo para fazer uma camada compacta na parte inferior, e em seguida coloque a seringa em um tubo Falcon 15 ml.
6. Misture bem a solução de Sephadex G50 em TE. Encha a seringa / coluna com esta solução.
7. Centrifugar a coluna por 30 segundos a 1000 rpm.
8. Repita este procedimento até que a coluna é quase completamente preenchida com Sephadex G50 contas.
9. Aplicar 200 mL de tampão de lavagem coluna para a coluna e centrifugar por 2 min a 1000 rpm. Descartar por escoamento.
10. Aplicar 200 mL de tampão de bloqueio coluna para a coluna e gire-a para 2 min a 1000 rpm. Repita este passo 4-5 vezes para equilibrar coluna. As colunas podem ser armazenados a 4 ° C até o uso se selado com Parafilm.

3. Rotulagem e Purificação de Riboprobes

Abaixo detalhamos a geração e purificação de riboprobe único. Para dFISH, a preparação de cada sonda irá envolver a mesma metodologia, exceto que uma das sondas será marcada com digoxigenina (DIG) marcadas UTP enquanto o outro com biotina marcadas UTP.

1. Preparar um concentrado (> 150 ng / mL) e purificado solução linearizada cDNA de interesse para gerar um sentido (controle) ou riboprobes antisense.
2. Em um microtubo de 1,5 ml, adicionar 0,5-1 mg de purificada modelo de cDNA, 2 mL de tampão 5X sonda rotulagem, 1 ml de 10X DIG (ou biotina), rotulagem mix, 0,5 mL de RNasin e 1 ml da RNA polimerase adequada , e trazer o volume final da solução para 10 ml com RNAse-free (DEPC-tratados) de água.
3. Incubar a solução em um banho de água a 37 ° C por 2 horas.
4. Adicionar 1 ml de tRNA (estoque, 20 mcg / mL), e 39 mL de tampão coluna de bloqueio para a solução.
5. Prepare o Sephadex G50 coluna para purificação da sonda. Para este fim, adicionar 50 mL tampão de bloqueio para a coluna e gire-a por 10 segundos a 1000 rpm.
   Repita este passo 2-3 vezes para equilibrar a coluna (ou seja, o total de 50 mL aplicada à coluna são recuperados após o ciclo de centrifugação).
6. Aplique a solução sonda para a coluna de Sephadex G50 posição, um tubo de microcentrífuga novo na parte inferior da coluna, e girá-lo por 3 min a 1000 rpm para obter o purificada 50 ml de solução riboprobe.
7. Avaliar a qualidade e rendimento de riboprobe rotulados usando um padrão de formaldeído-agarose gel RNA, ou um espectrofotômetro.

4. Pós-fixação Acetilação e Hibridização

1. Remove seções do freezer -80 ° C e permitir uma temperatura ambiente para equilibrar. Posteriormente, incubar seções em um frio, solução de paraformaldeído recém-made de 3% para 5 min.
2. Brevemente lavar seções em phosphate solução salina tamponada (PBS) por duas vezes.
3. Desidratar seções através de uma série de álcool normal (70, 95 e 100%; 2 min cada), e deixe-os secar ao ar.
4. Incubar seções em uma solução de acetilação de 10 min.
5. Enxágüe seções 3 vezes em 2X SSPE.
6. Desidratar seções, mais uma vez através da série de álcool padrão descrito acima, e permitir-lhes-ar seco.
7. Prepare um volume adequado de solução de hibridação e adicionar tanto riboprobes para a solução (concentração da sonda: 1 ng / mL para cada sonda). Volume total da solução de hibridização é determinada com base no número de seções para ser hibridizado (16 ml de solução de hibridização por seção).
8. Aplicar volume adequado da solução de hibridização para o tecido e lamínula slides garantir que nenhum ar overlay bolhas no tecido.
9. Coloque as lâminas em porta-lâminas de metal. Titular mergulhe em um banho de óleo mineral regulado a 65 ° C durante a noite. Garantir que as lamínulas são virados para cima (ou seja, o aspecto lateral do compartimento de slides deve estar em contato com o fundo do recipiente de óleo mineral).

5. Pós-hibridação Lava

1. No dia seguinte, remova cuidadosamente o suporte de slides do banho de óleo mineral e enxaguá-lo brevemente em clorofórmio para remover o excesso de óleo do slides.
2. Coloque as lâminas em uma solução de SSPE 2X de 5-10 min. Lamínulas devem separar de slides enquanto em solução.
3. Transferir as lâminas para uma nova solução de SSPE 2x, e mantê-los por 1 hr em temperatura ambiente.
4. Transferência de seções em uma solução contendo 2X SSPE além de formamida 50%. A temperatura desta solução deve coincidir com a temperatura utilizada no processo de hibridização durante a noite. Mantenha slides nesta solução por 1,5 hr.
5. Transferência de seções para uma solução de SSPE 0,1 x pré-aquecida à mesma temperatura da hibridação. Incubar seções nesta solução por 30 min. Repita este passo para um adicional de 30 min.

6. Detecção e Visualização de Riboprobes

1. Transferência de slides para o buffer TNT em que o peróxido de hidrogênio 0,3% foi adicionado, por 10 min.
2. Lave os cortes em TNT buffer, 3 vezes (10 min cada).
3. Usando uma caneta DAKO, desenhe um bem ao redor da área que contém as seções do cérebro. Importante, devem ser tomadas precauções para garantir que as seções não seca.
4. Aplicar 150 mL de tampão TNB a cada slide, e incubar seções nesta solução por 30 min, em câmara úmida.
5. Remoção da solução TNB excesso de slides de inclinação.
6. Aplicar 150 mL de solução contendo TNB conjugado com peroxidase de anticorpos anti-DIG e slides armazenar em câmara úmida por 2 horas. Concentração de anticorpos deve ser determinada individualmente para cada transcrição de interesse antes da realização dFISH.
7. Lave os cortes em TNT buffer; 3 vezes, 10 min cada.
8. Aplicar 150 mL de Alexa 594-conjugados solução tiramida trabalhando para cada slide, e armazená-los em câmara úmida por 1 hora. Esta solução deve ser preparada de acordo com as instruções do fabricante.
9. Lave os cortes em TNT buffer; 3 vezes, 10 min cada.
10. Seções incubar em tampão TNT para que o peróxido de hidrogênio 0,3% foi adicionado para 10-30 min.
11. Lave os cortes em TNT buffer; 3 vezes, 10 min cada.
12. Aplicar 150 mL de tampão TNB por lâmina, e mantê-los em câmara úmida por 30 min.
13. Remoção da solução TNB excesso de slides de inclinação.
14. Adicionar 150 mL de solução contendo TNB conjugado com peroxidase de anticorpos anti-biotina, e slides armazenar em câmara úmida por 2 horas.
15. Lave os cortes em TNT buffer; 3 vezes, 10 min cada.
16. Aplicar 150 mL de uma Alexa 488-conjugados solução tiramida trabalhando para os slides e seções incubar por 1 hora. Esta solução deve ser preparada de acordo com as recomendações do fabricante.
17. Lave os cortes em TNT buffer; 3 vezes, 10 min cada.
18. Adicionar 150 mL de solução de Hoechst (1:1000 em TNT buffer) para as seções e mantê-los na câmara úmida por 2 min.
19. Lavar as seções em TNT buffer; 3 vezes, 5 min cada.
20. Seções lamela com uma média de fluorescência compatível com a montagem (por exemplo, Vectashield ou prolongar Antifade).

7. Resultados representante

Figura 1. Mostramos aqui os resultados obtidos dFISH representante no cérebro de tentilhões-zebra. Mostrados são fotomicrografias obtidas a partir da nidopallium caudomedial (NCM), o análogo songbird do córtex auditivo de mamíferos. Seções do cérebro foram hibridizados com uma riboprobe biotinilado contra parvalbumina (A), um marcador para uma sub-população de neurônios inibitórios, e um DIG marcado ribosonda dirigida contra o dependente de atividade do gene Zenk (B), um marcador confiável para a canção-driven neurônios. C) Sobreposição de (A) e (B) mostra uma população de neurônios inibitórios que são ativadas pela experiência auditiva. Flechas e setas indicam células marcadas exclusivamente com cada um dos dois riboprobes, e asteriscos mostram neurônios representante co-expressar tanto transcrições de interesse. Barra de escala = 25 mm.

Discussion

Nós temos usado esse protocolo para estudar como o cérebro dos vertebrados é neuroquimicamente e funcionalmente organizado, e para determinar como comportamentalmente relevante impacto estímulos sensoriais as máquinas genômica de neurônios no cérebro adulto ^80-10. Temos utilizado com sucesso este método em tecido cerebral de camundongos, ratos e pássaros, mas antecipamos que este protocolo será facilmente adaptável às seções do cérebro obtidas a partir de uma variedade de espécies de vertebrados e, talvez, não-tecidos neurais. Controles-chave necessários para a obtenção de resultados confiáveis ​​e otimização do sinal foram detalhados extensivamente por nosso grupo em outros lugares ^{11, 12.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC	VWR international	IC15090225	toxic substance
PCR purification kit	Qiagen	28104
Formaldehyde	VWR international	BDH0506-4LP	toxic substance
T3 RNA polymerase	Roche Group	11031163001
T7 RNA polymerase	Roche Group	10881767001
Tris-HCl (1 M, pH 7.5)	VWR international	IC816124
MgCl2 (1 M)	Sigma-Aldrich	449172
Spermidine (1 M)	Sigma-Aldrich	S0266
DIG RNA labeling mix	Roche Group	NC9380805
Biotin RNA labeling mix	Roche Group	NC9440104
RNasin	Promega Corp.	N2111
BSA	Sigma-Aldrich	05491
DTT	Sigma-Aldrich	D5545
Sephadex G50	VWR international	95016-772
EDTA	VWR international	101384-758
SDS	Sigma-Aldrich	L4390
Transfer (t)RNA	Invitrogen	15401011
10X MOPS	VWR international	14221-398	toxic substance
Paraformaldehyde	VWR international	AAAL04737-36	toxic substance
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S3139
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S3264
NaOH	VWR international	SX0600-1
Triethanolamine	VWR international	IC15216391
Acetic anhydride	VWR international	MK242002	toxic substance
SSPE	VWR international	82021-488
Formamide	VWR international	JT4028-1	toxic substance
Poly A	Invitrogen	POLYA.GF
Mineral oil	VWR international	IC15169491
Chloroform	VWR international	BDH1109	organic solvent
Deionized formamide	Sigma-Aldrich	F9037	toxic substance
Hydrogen peroxide	VWR international	VW36901	toxic substance
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Triton X-100	JT Baker	X198-05
Anti-DIG HRP	Roche Group	11093274910
Anti-biotin peroxidase	Vector Laboratories	SP3010
TSA Alexa Fluor 594	Invitrogen	T20935
TSA Alexa Fluor 488	Invitrogen	T20932
H–chst	VWR international	200025-538
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
embedding mold	VWR international	15160-157
cryostat	Leica Microsystems	CM 1850
Superfrost plus slide	VWR international	89033-052
Solutions Column washing buffer: 10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05 mM EDTA, 50 μg/μl tRNA, 0.1% SDS in 50 ml DEPC-treated water. Column blocking buffer: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA in 50 ml DEPC-treated water. TNT buffer: 60 ml of 1 M Tris-HCl, 18 ml of 5 M NaCl and 1.8 ml of Triton X-100 in 600 ml of DEPC-treated water. TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8.3 μg/μl BSA, 0.15 M NaCl and 3% Triton X-100 in DEPC-treated water. TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 plus 1 mM EDTA, pH 7.5. Acetylation solution: 2.7 ml of triethanolamine plus 0.5 ml of acetic anhydride in 200 ml of DEPC-treated water. Hybridization solution: 50% formamide, 2X SSPE, 2 μg/μl tRNA, 1 μg/μl BSA and 1 μg/μl poly A in DEPC-treated water. It needs 16 l per section.