Дважды флуоресценции На месте Гибридизация в пресной разделы мозга

Summary

Этот протокол предполагает нерадиоактивных

Abstract

Здесь мы опишем модифицированной версией двойной флуоресценции

Protocol

Этот протокол был разработан и уточнены на основе стандартных радиоактивных и нерадиоактивных на месте гибридизация методы, ранее разработанные нами и другими для выявления одного или двух видов стенограмму в ткани головного мозга ^1-7. Протокол, описанный ниже, общая длина 2 или 3 дня, в зависимости от ряда процедурных перерывов выбран конечным пользователем. Все шаги, описанные ниже, должны быть проведены при комнатной температуре, за исключением шага riboprobe гибридизации и пост-гибридизации стирок. Растворов и буферов, необходимых для всех этапов этого метода можно найти в конце этого протокола.

1. Подготовка тканей и Секционирование

1. Обезглавьте и извлечь мозг испытуемого быстро, и поместите его в пластиковые формы адекватного размера.
2. Обложка мозг ткани-Tek среда вложения и быстро местом для литья пластмасс в dry-ice/alcohol ванны для быстрого замораживания. Замороженные ткани могут храниться при температуре -80 ° С до использования.
3. Использование криостат, собирать 2 или 3 мозга разделы на слайд на заряженные SuperFrost Плюс слайдов. Толщина секций должна быть 10-12 мкм. Слайды можно хранить при температуре -80 ° С до использования.

2. Подготовка сефадексе G50 столбцов для очистки зонда

"Сефадексом колонки могут быть приобретены из коммерческих источников, однако, мы приводим ниже недорогой альтернативой для создания колонн, которые будут необходимы для зонда очистки.

1. Гидратов достаточное количество сефадексе G50 порошок РНКазой, свободной, DEPC обработанной воды (например, 2 г порошка в 100 мл DEPC-очищенной воды), кратко перемешать раствор и хранить при комнатной температуре для осаждения избыточных сефадексе G50.
2. Удалить супернатант (верхний слой воды) после сефадексе G50 осадков.
3. Повторите этот процесс более 3 - 5 раз.
4. После последней промывки, вновь приостановить сефадексе G50 решение в ТЕ буфере (1:1), и храните при температуре 4 ° С до использования.
5. Место автоклавного стекловаты в стерильный шприц 1 мл и сжимать его с поршнем, чтобы сделать компактный слой на дне, а затем поместить шприца в трубку 15 мл Falcon.
6. Хорошо перемешайте решение сефадексе G50 в ТЕ. Заполните шприц / столбец с этим решением.
7. Центрифуга колонку в течение 30 сек при 1000 оборотах в минуту.
8. Повторите эту процедуру, пока колонна почти полностью заполнены сефадексе G50 бисером.
9. Применяют по 200 мкл промывочного буфера колонки к колонке и центрифуги в течение 2 мин при 1000 оборотах в минуту. Отменить проточные.
10. Применяют по 200 мкл блокирующего буфера колонки к колонке и вращать его в течение 2 мин при 1000 оборотах в минуту. Повторите этот шаг 4-5 раз, чтобы уравновесить колонке. Столбцы можно хранить при 4 ° С до использования, если запечатанный парафильмом.

3. Маркировка и очистка Riboprobes

Ниже мы подробно поколения и очистки одного riboprobe. Для dFISH, подготовка каждый зонд будет включать в себя ту же методологию, за исключением того, что один из зондов будет помечена дигоксигенин (DIG) с метками UTP в то время как другие с биотином, помеченные UTP.

1. Подготовка концентрированной (> 150 нг / мкл) и очищенный линеаризованной кДНК решение представляет интерес для создания либо смысла (контроль) или антисмысловых riboprobes.
2. В 1,5 трубки микроцентрифужную мл, добавить 0,5-1 мкг очищенной кДНК шаблон, 2 мкл 5X буфера маркировки зонд, 1 мкл 10X DIG (или биотин) маркировки смеси, 0,5 мкл RNasin и 1 мкл соответствующего РНК-полимеразы и принести окончательный объем раствора до 10 мкл РНКазы без (DEPC обработанных) воды.
3. Инкубируйте раствор в водяной бане при температуре 37 ° С в течение 2 часов.
4. Добавить 1 мкл тРНК (акции, 20 мкг / мкл), и 39 мкл блокирующего буфера колонки к решению.
5. Подготовка Sephadex G50 колонке для зонда очистки. С этой целью, добавить 50 мкл блокирующего буфера в колонну и вращать его в течение 10 сек при 1000 оборотах в минуту.
   Повторите этот шаг 2-3 раза, чтобы уравновесить колонки (то есть, полный 50 мкл применяется к столбцу восстанавливаются после цикла центрифугирования).
6. Применение датчика решение колонке Сефадекс G50, положение новой трубки микроцентрифужную в нижней части колонки, и вращать его в течение 3 мин при 1000 оборотов в минуту для получения очищенной 50 мкл riboprobe решение.
7. Оценка качества и урожайности меченых riboprobe используя либо стандартный формальдегид-РНК в агарозном геле, или спектрофотометр.

4. После фиксации, ацетилирование и гибридизация

1. Удалите разделы из морозильной камеры -80 ° С и позволяют комнатной температуре, чтобы уравновесить. Впоследствии, инкубировать секций в холодную, только что составила 3% параформальдегида решение в течение 5 мин.
2. Кратко промыть секций в рhosphate солевым буфером (PBS) в два раза.
3. Дегидрировать разделы по стандартной серии алкоголя (70, 95 и 100%; 2 мин каждый), и пусть они воздушно-сухой.
4. Инкубируйте разделы ацетилирования раствор на 10 мин.
5. Промыть разделах 3 раза в 2х ГНПП.
6. Дегидрировать разделы еще раз через стандартные серии алкоголя, описанных выше, и дать им высохнуть на воздухе.
7. Подготовка соответствующего объема гибридизации решение и добавить оба riboprobes к решению (датчик концентрации: 1 нг / мкл для каждого зонда). Общий объем гибридизации решения определяется на основе ряда разделов будет гибридизированных (16 мкл гибридизации раствора на раздел).
8. Применить адекватные объемы гибридизации решение ткани и покровное слайды гарантируя, что ни наложения пузырьки воздуха ткани.
9. Место слайды в держатель слайдов металла. Опустите держатель в масляной ванне минеральных установлена ​​на уровне 65 ° С в течение ночи. Убедитесь, что покровные являются вверх (то есть, наружной стороны держателя слайдов должно быть в контакте с нижней части контейнера минеральное масло).

5. После гибридизации Моет

1. На следующий день, осторожно снимите держатель слайдов из ванны минеральные масла и кратко промыть его в хлороформе, чтобы удалить излишки масла из слайдов.
2. Место слайдов в решении 2х ГНПП течение 5-10 мин. Покровные стекла должны отделяться от слайды в то время как в растворе.
3. Передача слайдов новое решение 2X ГНПП, и держать их в течение 1 часа при комнатной температуре.
4. Передача участков в раствор, содержащий 2X ГНПП плюс 50% формамида. Температура этого решения должна соответствовать температуре, используемые в ночь процедуру гибридизации. Хранить слайды в этом растворе в течение 1,5 часов.
5. Передача разделы решение 0.1X ГНПП предварительно нагревают до той же температуре гибридизации шаг. Инкубируйте разделы в этом растворе в течение 30 мин. Повторите этот шаг еще в течение 30 мин.

6. Обнаружение и визуализация Riboprobes

1. Передача слайды в буфер ТНТ которых 0,3% перекиси водорода был добавлен, в течение 10 мин.
2. Вымойте секций в тротиловом буфера, в 3 раза (10 минут каждый).
3. Использование пера DAKO, рисовать и во всем районе, мозг разделов. Важно отметить, что следует проявлять осторожность, чтобы разделы не сухим.
4. Применить 150 мкл буфера для ТНБ каждого слайда, и инкубировать разделы в этом растворе в течение 30 мин, во влажной камере.
5. Удалите излишки решение ТНБ, наклоняя слайдов.
6. Применяют по 150 мкл раствора, содержащего TNB пероксидаза-сопряженных анти-DIG антитела, и хранить слайды во влажной камере в течение 2 часов. Антитела концентрация должна определяться индивидуально для каждого стенограмму интересов до проведения dFISH.
7. Вымойте секций в тротиловом буфера; 3 раза, 10 минут каждый.
8. Применить 150 мкл Alexa 594-сопряженных tyramide рабочего раствора для каждого слайда, и хранить их во влажной камере в течение 1 часа. Это решение должно быть подготовлено в соответствии с указаниями производителя.
9. Вымойте секций в тротиловом буфера; 3 раза, 10 минут каждый.
10. Инкубируйте секций в буфер ТНТ которых 0,3% перекиси водорода был добавлен в течение 10 - 30 мин.
11. Вымойте секций в тротиловом буфера; 3 раза, 10 минут каждый.
12. Применить 150 мкл буфера ТНБ на слайд, и держать их во влажной камере в течение 30 мин.
13. Удалите излишки решение ТНБ, наклоняя слайдов.
14. Добавить 150 мкл раствора, содержащего TNB пероксидаза-сопряженных анти-биотин антитела, и хранить слайды во влажной камере в течение 2 часов.
15. Вымойте секций в тротиловом буфера; 3 раза, 10 минут каждый.
16. Применить 150 мкл Alexa 488-сопряженных tyramide рабочего раствора для слайдов и инкубировать разделы в течение 1 часа. Это решение должно быть подготовлено в соответствии с рекомендациями производителя.
17. Вымойте секций в тротиловом буфера; 3 раза, 10 минут каждый.
18. Добавить 150 мкл Hoechst раствора (1:1000 в тротиловом буфера) для разделов и держать их во влажной камере в течение 2 мин.
19. Вымойте секций в тротиловом буфера; 3 раза, 5 мин каждый.
20. Покровное секций с флуоресценции-совместимые монтажные среды (например, Vectashield или продлить antifade).

7. Представитель Результаты

Рисунок 1. Здесь мы показываем, репрезентативные результаты, полученные в dFISH мозга зебры зяблик. Показаны микрофотографии полученных из caudomedial nidopallium стран (СМСС), аналог певчих птиц, млекопитающих кора аудитории. Мозг разделы подвергали гибридизации с биотинилированного riboprobe направлена ​​против парвальбумина (А), маркером субпопуляции тормозящие нейроны, и DIG-меченых рибоЗонд направлены против деятельности зависит от генов zenk (Б), надежным маркером песни управляемых нейронами. С) Наложение (А) и (Б) показывает населения тормозных нейронов, которые активируются слуховой опыт. Стрелки и наконечники стрел свидетельствуют клетки помечены исключительно с каждой из двух riboprobes, и звездочки показывают представитель нейронов совместного выражения и стенограммы интерес. Шкала бар = 25 мкм.

Discussion

Мы использовали этот протокол для изучения того, как мозг позвоночных neurochemically и функционально организованным, и определить, как поведенчески-сенсорного воздействия соответствующих стимулов геномный механизм нейроны во взрослом мозге ^8-10. Мы успешно использовали этот метод в ткани головного мозга мышей, крыс и певчих птиц, но ожидаем, что этот протокол будет легко адаптируется к мозгу разделы получена из массива видов позвоночных и, возможно, без нервной ткани. Основные контроля, необходимых для получения достоверных результатов и оптимального сигнала были подробно широко нашей группой в другом месте ^{11, 12.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC	VWR international	IC15090225	toxic substance
PCR purification kit	Qiagen	28104
Formaldehyde	VWR international	BDH0506-4LP	toxic substance
T3 RNA polymerase	Roche Group	11031163001
T7 RNA polymerase	Roche Group	10881767001
Tris-HCl (1 M, pH 7.5)	VWR international	IC816124
MgCl2 (1 M)	Sigma-Aldrich	449172
Spermidine (1 M)	Sigma-Aldrich	S0266
DIG RNA labeling mix	Roche Group	NC9380805
Biotin RNA labeling mix	Roche Group	NC9440104
RNasin	Promega Corp.	N2111
BSA	Sigma-Aldrich	05491
DTT	Sigma-Aldrich	D5545
Sephadex G50	VWR international	95016-772
EDTA	VWR international	101384-758
SDS	Sigma-Aldrich	L4390
Transfer (t)RNA	Invitrogen	15401011
10X MOPS	VWR international	14221-398	toxic substance
Paraformaldehyde	VWR international	AAAL04737-36	toxic substance
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S3139
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S3264
NaOH	VWR international	SX0600-1
Triethanolamine	VWR international	IC15216391
Acetic anhydride	VWR international	MK242002	toxic substance
SSPE	VWR international	82021-488
Formamide	VWR international	JT4028-1	toxic substance
Poly A	Invitrogen	POLYA.GF
Mineral oil	VWR international	IC15169491
Chloroform	VWR international	BDH1109	organic solvent
Deionized formamide	Sigma-Aldrich	F9037	toxic substance
Hydrogen peroxide	VWR international	VW36901	toxic substance
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Triton X-100	JT Baker	X198-05
Anti-DIG HRP	Roche Group	11093274910
Anti-biotin peroxidase	Vector Laboratories	SP3010
TSA Alexa Fluor 594	Invitrogen	T20935
TSA Alexa Fluor 488	Invitrogen	T20932
H–chst	VWR international	200025-538
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
embedding mold	VWR international	15160-157
cryostat	Leica Microsystems	CM 1850
Superfrost plus slide	VWR international	89033-052
Solutions Column washing buffer: 10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05 mM EDTA, 50 μg/μl tRNA, 0.1% SDS in 50 ml DEPC-treated water. Column blocking buffer: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA in 50 ml DEPC-treated water. TNT buffer: 60 ml of 1 M Tris-HCl, 18 ml of 5 M NaCl and 1.8 ml of Triton X-100 in 600 ml of DEPC-treated water. TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8.3 μg/μl BSA, 0.15 M NaCl and 3% Triton X-100 in DEPC-treated water. TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 plus 1 mM EDTA, pH 7.5. Acetylation solution: 2.7 ml of triethanolamine plus 0.5 ml of acetic anhydride in 200 ml of DEPC-treated water. Hybridization solution: 50% formamide, 2X SSPE, 2 μg/μl tRNA, 1 μg/μl BSA and 1 μg/μl poly A in DEPC-treated water. It needs 16 l per section.