Doble fluorescencia In situ La hibridación en las secciones del cerebro fresco

Summary

Este protocolo consiste en un no-radiactivos

Abstract

Aquí se describe una versión modificada de un fluorescente doble

Protocol

Este protocolo fue desarrollado y perfeccionado sobre la base de los métodos estándar de hibridación radiactivos y no radiactivos in situ, desarrollado previamente por nosotros y otros para detectar una o dos especies de transcripción en el tejido cerebral ^1-7. El protocolo se describe a continuación tiene una longitud total de 2 o 3 días, dependiendo del número de interrupciones del procedimiento elegido por el usuario final. Todos los pasos detallados a continuación se llevarán a cabo a temperatura ambiente, con la excepción de la etapa de hibridación riboprobe y se lava después de la hibridación. Las soluciones y tampones necesarios para todas las etapas de este método se puede encontrar al final de este protocolo.

1. Preparación del tejido y corte

1. Decapitar y extracto de cerebro de sujetos en rápido, y colocarlo en un molde de plástico de tamaño adecuado.
2. Cubren el cerebro con Tissue-Tek medio de inclusión y rápidamente colocar el molde de plástico en un baño de dry-ice/alcohol de congelación rápida. El tejido congelado se puede almacenar a -80 ° C hasta su uso.
3. El uso de un criostato, recoger dos o tres secciones del cerebro por diapositiva en Superfrost Plus diapositivas cargado. Espesor de las secciones debe ser 10-12 micras. Las diapositivas se pueden almacenar a -80 ° C hasta su uso.

2. Preparación de Sephadex G50 columnas para la purificación de la sonda

"Columnas de Sephadex se pueden adquirir de fuentes comerciales, sin embargo, a continuación una alternativa de bajo costo para la generación de columnas, que se requiere para la purificación de la sonda.

1. Cantidad adecuada de hidratos de Sephadex G50 en polvo con RNasa libre, agua tratada con DEPC (por ejemplo, 2 g de polvo en 100 ml de agua tratada con DEPC), una breve solución de mezclar y almacenar a temperatura ambiente para precipitar el exceso de Sephadex G50.
2. Aspirar el sobrenadante (la capa superior de agua) después de Sephadex G50 precipitación.
3. Repita el proceso por encima del 3 - 5 veces.
4. Después del lavado final, volver a suspender las Sephadex G50 solución en buffer TE (1:1), y se almacenan a 4 ° C hasta su uso.
5. Coloque el autoclave lana de vidrio en una jeringa estéril de 1 y comprimir con el émbolo para hacer una capa compacta en la parte inferior, y luego colocar la jeringa en un tubo Falcon de 15 ml.
6. Mezcle bien la solución de Sephadex G50 en TE. Llene la jeringa / columna con esta solución.
7. Centrifugar la columna durante 30 segundos a 1000 rpm.
8. Repita este procedimiento hasta que la columna está casi completamente lleno de Sephadex G50 cuentas.
9. Aplicar 200 l de tampón de columna de lavado a la columna y centrifugar durante 2 min a 1000 rpm. Desechar el filtrado.
10. Aplicar 200 l de tampón de columna de bloqueo a la columna y girar durante 2 min a 1000 rpm. Repita este paso 4-5 veces para equilibrar la columna. Las columnas pueden ser almacenadas a 4 ° C hasta su uso si sellado con Parafilm.

3. Etiquetado y purificación de ribosondas

A continuación se detallan la generación y purificación de un riboprobe sola. Para dFISH, la preparación de cada sonda implicará la misma metodología, excepto que una de las sondas serán marcadas con digoxigenina (DIG)-etiquetados UTP mientras que el otro con biotina-etiquetados UTP.

1. Prepare una solución concentrada (> 150 ng / l) y se purifica solución linealizada cDNA de interés para generar uno u otro sentido (control) o riboprobes antisentido.
2. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, agregar 0,5-1 g de agua purificada plantilla de cDNA, 2 l de tampón 5X etiquetado sonda, 1 l de DIG 10 veces (o biotina)-etiquetado mezcla, 0,5 l de RNasin y 1 l de la correspondiente ARN polimerasa , y llevar el volumen final de la solución a 10 ml con RNasa libre (tratada con DEPC) de agua.
3. Incube la solución en un baño de agua a 37 ° C durante 2 horas.
4. Añadir 1 l de tRNA (stock; 20 mg / l), y 39 l de tampón de columna de bloqueo a la solución.
5. Prepare la columna de Sephadex G50 para la purificación de la sonda. Con este fin, se añaden 50 l buffer de bloqueo a la columna y girar durante 10 segundos a 1000 rpm.
   Repita este paso 2-3 veces para equilibrar la columna (es decir, la totalidad de 50 l aplicada a la columna se recuperan después de un ciclo de centrifugado).
6. Aplique la solución de prueba a la columna de Sephadex G50, la posición de un tubo de microcentrífuga nuevo en la parte inferior de la columna, y girar durante 3 minutos a 1000 rpm para obtener el purificada 50 l de solución riboprobe.
7. Evaluar la calidad y el rendimiento de riboprobe etiquetados utilizando una norma de formaldehído-agarosa ARN gel, o un espectrofotómetro.

4. Posterior a la fijación, acetilación y de hibridación

1. Eliminar secciones de la 80 ° C congelador y permitir una temperatura ambiente que se equilibre. Posteriormente, se incuban las secciones de un frío, recién hechas solución de paraformaldehído al 3% durante 5 min.
2. Brevemente enjuague secciones en phosphate solución salina (PBS) dos veces.
3. Deshidratar secciones a través de una serie estándar de alcohol (70, 95 y 100%, 2 minutos cada uno), y dejar que se seque al aire.
4. Incubar las secciones en una solución de acetilación de 10 min.
5. Enjuague las secciones 3 veces en 2 veces la SSPE.
6. Deshidratar secciones, una vez más a través de la serie estándar de alcohol se ha descrito anteriormente, y permitir que se seque al aire.
7. Preparar un volumen adecuado de solución de hibridación y añadir tanto riboprobes a la solución (concentración de la sonda: 1 ng / l para cada sonda). Volumen total de la solución de hibridación se determina en función del número de secciones que se han hibridado (16 l de solución de hibridación por sección).
8. Aplicar volumen adecuado de la solución de hibridación en las diapositivas de tejidos y cubreobjetos asegurar que el aire no superposición de las burbujas de los tejidos.
9. Coloque los portaobjetos en un soporte de diapositivas de metal. Titular de sumergirse en un baño de aceite mineral a los 65 ° C durante la noche. Asegúrese de que los cubreobjetos son hacia arriba (es decir, la parte lateral del soporte de diapositivas debe estar en contacto con el fondo del recipiente de aceite mineral).

5. La hibridación después de Lava

1. Al día siguiente, retirar con cuidado el soporte de diapositivas del baño de aceite mineral y brevemente se aclare en cloroformo para eliminar el exceso de grasa de las diapositivas.
2. Coloque los portaobjetos en una solución de 2X PES durante 5-10 minutos. Cubreobjetos debe desprenderse de diapositivas, mientras que en la solución.
3. Transferencia de las diapositivas de una nueva solución de 2X SSPE, y mantenerlos durante 1 hora a temperatura ambiente.
4. Transferencia de secciones en una solución que contiene la SSPE 2X más el 50% de formamida. La temperatura de esta solución debe coincidir con la temperatura utilizada en el procedimiento de hibridación noche a la mañana. Mantenga las diapositivas en esta solución durante 1,5 horas.
5. Transferencia de las secciones a una solución 0.1X PEES pre-calentado a la misma temperatura de la etapa de hibridación. Incubar las secciones en esta solución durante 30 minutos. Repita este paso para un período adicional de 30 min.

6. Detección y visualización de ribosondas

1. Transferencia de diapositivas para amortiguar TNT a las que 0,3% de peróxido de hidrógeno se ha añadido, durante 10 minutos.
2. Lávese las secciones de TNT buffer, 3 veces (10 minutos cada uno).
3. El uso del lápiz Dako, dibujar un pozo en la zona que contiene las secciones del cerebro. Es importante destacar que se debe tener precaución para que los artículos no se sequen.
4. Aplicar 150 l de tampón TNB a cada diapositiva, e incubar las secciones en esta solución durante 30 minutos, en una cámara húmeda.
5. Retire el exceso de solución TNB diapositivas inclinación.
6. Aplicar 150 ml de solución contiene TNB conjugado con peroxidasa anti-DIG anticuerpos, y se desliza almacenar en una cámara húmeda durante 2 horas. Concentración de anticuerpos debe determinarse individualmente para cada una transcripción de interés antes de realizar dFISH.
7. Lávese las secciones de TNT buffer, 3 veces, 10 minutos cada uno.
8. Aplicar 150 ml de Alexa 594-conjugado solución tyramide de trabajo para cada diapositiva, y almacenarlos en una cámara húmeda durante 1 hora. Esta solución debe prepararse de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
9. Lávese las secciones de TNT buffer, 3 veces, 10 minutos cada uno.
10. Secciones se incuban en un tampón de TNT a las que 0,3% de peróxido de hidrógeno se ha añadido durante 10 - 30 min.
11. Lávese las secciones de TNT buffer, 3 veces, 10 minutos cada uno.
12. Aplicar 150 l de tampón TNB por diapositiva, y mantenerlas en una cámara húmeda durante 30 minutos.
13. Retire el exceso de solución TNB diapositivas inclinación.
14. Añadir 150 ml de solución de TNB que contienen conjugado de peroxidasa anti-biotina de anticuerpos, y se desliza almacenar en una cámara húmeda durante 2 horas.
15. Lávese las secciones de TNT buffer, 3 veces, 10 minutos cada uno.
16. Aplicar 150 ml de un Alexa 488-conjugado solución tyramide de trabajo a las diapositivas y las secciones se incuban durante 1 hora. Esta solución debe prepararse de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
17. Lávese las secciones de TNT buffer, 3 veces, 10 minutos cada uno.
18. Añadir 150 ml de solución de Hoechst (1:1000 en buffer de TNT) a las secciones y los mantienen en la cámara húmeda durante 2 min.
19. Lave las secciones de TNT buffer; 3 veces, 5 minutos cada uno.
20. Cubreobjetos secciones con un medio de fluorescencia compatible con el montaje (por ejemplo, Vectashield o prolongar Antifade).

7. Resultados representante

Figura 1. Mostramos aquí los resultados obtenidos dFISH representante en el cerebro pinzón cebra. Se muestran microfotografías obtenidas de la caudomedial nidopallium (NCM), el análogo de pájaro cantor de la corteza auditiva de mamíferos. Secciones del cerebro se hibridó con una riboprobe biotinilado dirigido contra parvalbúmina (A), un marcador de una subpoblación de neuronas inhibitorias, y una marcada con DIG riboinvestigación dirigida contra el Zenk dependiente de la actividad del gen (B), un marcador fiable para impulsada canción neuronas. C) Superposición de (A) y (B) muestra una población de neuronas inhibitorias que se activan por la experiencia auditiva. Flechas y puntas de flecha indican las células marcadas exclusivamente con cada uno de los dos riboprobes y asteriscos muestran las neuronas representante co-expresión de ambas transcripciones de interés. Barra de escala = 25 micras.

Discussion

Hemos utilizado este protocolo para estudiar cómo el cerebro de los vertebrados es neuroquímico y funcionalmente organizada, y para determinar la conducta relevante impacto estímulos sensoriales de la maquinaria del genoma de las neuronas en el cerebro adulto ^80-10. Hemos utilizado con éxito este método en el tejido cerebral de ratones, ratas y pájaros, pero anticipamos que este protocolo se adapta fácilmente a las secciones del cerebro obtenidas de una gran variedad de especies de vertebrados y, quizás, los tejidos no neuronales. Controles clave necesarios para la obtención de resultados fiables y óptima de la señal se han detallado extensamente por nuestro grupo en otros lugares ^{11, 12.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC	VWR international	IC15090225	toxic substance
PCR purification kit	Qiagen	28104
Formaldehyde	VWR international	BDH0506-4LP	toxic substance
T3 RNA polymerase	Roche Group	11031163001
T7 RNA polymerase	Roche Group	10881767001
Tris-HCl (1 M, pH 7.5)	VWR international	IC816124
MgCl2 (1 M)	Sigma-Aldrich	449172
Spermidine (1 M)	Sigma-Aldrich	S0266
DIG RNA labeling mix	Roche Group	NC9380805
Biotin RNA labeling mix	Roche Group	NC9440104
RNasin	Promega Corp.	N2111
BSA	Sigma-Aldrich	05491
DTT	Sigma-Aldrich	D5545
Sephadex G50	VWR international	95016-772
EDTA	VWR international	101384-758
SDS	Sigma-Aldrich	L4390
Transfer (t)RNA	Invitrogen	15401011
10X MOPS	VWR international	14221-398	toxic substance
Paraformaldehyde	VWR international	AAAL04737-36	toxic substance
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S3139
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S3264
NaOH	VWR international	SX0600-1
Triethanolamine	VWR international	IC15216391
Acetic anhydride	VWR international	MK242002	toxic substance
SSPE	VWR international	82021-488
Formamide	VWR international	JT4028-1	toxic substance
Poly A	Invitrogen	POLYA.GF
Mineral oil	VWR international	IC15169491
Chloroform	VWR international	BDH1109	organic solvent
Deionized formamide	Sigma-Aldrich	F9037	toxic substance
Hydrogen peroxide	VWR international	VW36901	toxic substance
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Triton X-100	JT Baker	X198-05
Anti-DIG HRP	Roche Group	11093274910
Anti-biotin peroxidase	Vector Laboratories	SP3010
TSA Alexa Fluor 594	Invitrogen	T20935
TSA Alexa Fluor 488	Invitrogen	T20932
H–chst	VWR international	200025-538
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
embedding mold	VWR international	15160-157
cryostat	Leica Microsystems	CM 1850
Superfrost plus slide	VWR international	89033-052
Solutions Column washing buffer: 10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05 mM EDTA, 50 μg/μl tRNA, 0.1% SDS in 50 ml DEPC-treated water. Column blocking buffer: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA in 50 ml DEPC-treated water. TNT buffer: 60 ml of 1 M Tris-HCl, 18 ml of 5 M NaCl and 1.8 ml of Triton X-100 in 600 ml of DEPC-treated water. TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8.3 μg/μl BSA, 0.15 M NaCl and 3% Triton X-100 in DEPC-treated water. TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 plus 1 mM EDTA, pH 7.5. Acetylation solution: 2.7 ml of triethanolamine plus 0.5 ml of acetic anhydride in 200 ml of DEPC-treated water. Hybridization solution: 50% formamide, 2X SSPE, 2 μg/μl tRNA, 1 μg/μl BSA and 1 μg/μl poly A in DEPC-treated water. It needs 16 l per section.