Utero electroporation vivo में neuronal पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं transfecting के लिए एक मूल्यवान तरीका है . इलेक्ट्रोड और electroporation की विकास timepoint के स्थान पर निर्भर करता है, cortical कोशिकाओं के कुछ सबसेट को लक्षित किया जा सकता है. लक्षित कोशिकाओं तो vivo में या आनुवंशिक परिवर्तन के प्रभाव के लिए इन विट्रो में विश्लेषण किया जा सकता है.
प्राथमिक neuronal संस्कृतियों के इन विट्रो अध्ययन में neurite परिणाम की मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है . आदेश में अध्ययन करने के लिए कैसे आनुवंशिक परिवर्तन neuronal प्रक्रिया के परिणाम, shRNA या सीडीएनए constructs रासायनिक अभिकर्मक या वायरल पारगमन के माध्यम से प्राथमिक न्यूरॉन्स में पेश किया जा सकता है है प्रभावित है. हालांकि, प्राथमिक cortical कोशिकाओं के साथ, सेल प्रकार (विभिन्न परतों, निरोधात्मक न्यूरॉन्स, glial कोशिकाओं से glutamatergic न्यूरॉन्स) के एक विषम पूल इन तरीकों का उपयोग ट्रांसफ़ेक्ट हैं. भ्रूण कृंतक प्रांतस्था में डीएनए constructs परिचय utero electroporation में के उपयोग के लिए लक्षित किया जा कोशिकाओं के कुछ सबसेट के लिए अनुमति देता है: जबकि जल्दी प्रांतस्था के भ्रूण प्रांतस्था लक्ष्य गहरी परतों के electroporation देर भ्रूण timepoints पर electroporation अधिक सतही परतों लक्ष्य. इसके अलावा, प्रांतस्था के पृष्ठीय औसत दर्जे बनाम उदर – पार्श्व क्षेत्रों का लक्ष्यीकरण में व्यक्तिगत भ्रूण परिणामों के सिर में इलेक्ट्रोड के अंतर स्थान. Electroporation के बाद, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं बाहर dissected किया जा सकता है, अलग, और neurite परिणाम के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए इन विट्रो में मढ़वाया. यहाँ, हम एक कदम दर कदम विधि करने के लिए मात्रात्मक cortical कोशिकाओं के सबसेट में neuronal प्रक्रिया परिणाम उपाय प्रदान करते हैं.
utero electroporation में के लिए बुनियादी प्रोटोकॉल Kriegstein प्रयोगशाला 1, 2 से दो अन्य जौव लेख में विस्तार में वर्णित किया गया है. हम utero electroporation में के लिए हमारे प्रोटोकॉल के एक सिंहावलोकन है, सबसे महत्वपूर्ण विवरण पर ध्यान केंद्रित, हमारे प्रोटोकॉल है कि utero electroporation में neuronal प्रक्रिया के परिणाम में जीन समारोह के अध्ययन के लिए लागू होता है की एक विवरण के द्वारा पीछा प्रदान करेगा.
प्राथमिक neuronal संस्कृतियों के इन विट्रो अध्ययन में neurite परिणाम की मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं . आदेश में अध्ययन करने के लिए कैसे आनुवंशिक परिवर्तन neuronal प्रक्रिया के परिणाम को प्रभावि…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों के लिए इस तकनीक पर उपयोगी विचार – विमर्श के लिए यूसुफ LoTurco और डेनिस Selkoe धन्यवाद देना चाहूंगा. लेखकों अमेरिकी स्वास्थ्य सहायता फाउंडेशन के दानदाताओं इस शोध के समर्थन के लिए धन्यवाद.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Cortical Neuron Preparation | ||||
Dissection Media: | ||||
10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free) | Gibco | 14185-052 | ||
10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 ) | Gibco | 14065-056 | ||
1M HEPES pH 7.4 | Gibco | 15630-080 | ||
Dishes and Vials: | ||||
100 x 15 mm Petri Dishes | Fisherbrand | 08-757-12 | ||
60 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351007 | ||
15 mL conical vial | Sarstedt | 62-547-205 | ||
50 mL conical vial | Sarstedt | 62-554-205 | ||
Dissection Tools: | ||||
Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | ||
Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | ||
Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | ||
Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | ||
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | ||
Miscellaneous: | ||||
.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | ||
Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | ||
Hand-Held Tally Counter | Sigma | Z169021 | ||
Plating Medium: | ||||
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) | Gibco | 11960-051 | ||
Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
L-glutamine | Gibco | 25030 | ||
Growth Medium: | ||||
NEUROBASAL Medium | Gibco | 21103-049 | ||
B-27 Serum-Free Supplement | Gibco | 17504-044 | ||
GlutaMAX -I Supplement | Gibco | 35050-061 | ||
Gentamicin Reagent Solution | Gibco | 15750-060 | ||
Immunostaining: | ||||
Fixative, Washes, and Blocking Buffer: | ||||
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||
Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | ||
Triton X-100 | Sigma | T9284 | ||
Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | ||
Antibodies: | ||||
beta-III tubulin antibody | Chemicon | MAB1637 | ||
MAP2 antibody | Chemicon | AB15452 | ||
Donkey Cy3 anti-mouse | Jackson Immuno | 715-166-151 | ||
Donkey Cy2 anti-chicken | Jackson Immuno | 703-226-155 | ||
DAPI | Gibco | D3571 | ||
Slide Preparation: | ||||
CC2 Coated Two-Chamber Slides | Lab-Tek | 154852 | ||
Fluorescent Mounting Media | KPL | 71-00-16 | ||
24 x 60 mm Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | ||
Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | ||
Electroporation: | ||||
Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | ||
Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | ||
buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | ||
Picospritzer III | Parker | |||
BTX square wave electroporator | Fisher | BTXECM830 | ||
Tweezertrodes, 7 mm, platinum | Harvard Apparatus | 450488 |