Summary
electroporation في الرحم هو وسيلة قيمة لtransfecting الخلايا الاصلية العصبية في الجسم الحي. تبعا للوضع الأقطاب وtimepoint التنموية للelectroporation ، يمكن استهداف مجموعات فرعية معينة من الخلايا القشرية. ويمكن بعد ذلك أن تحلل الخلايا المستهدفة في الجسم الحي أو في المختبر لآثار التغير الجيني.
Abstract
الدراسة في المختبر من الثقافات العصبية الأولية يسمح لتحليلات كمية من ثمرة neurite. من أجل دراسة كيفية تغيرات جينية تؤثر على الخلايا العصبية ثمرة عملية ، أو يمكن shRNA قدم يبني [كدنا] في الخلايا العصبية الأولية عن طريق ترنسفكأيشن الكيميائية أو تنبيغ الفيروسية. ومع ذلك ، مع الخلايا القشرية الأولية ، هي transfected مجموعة غير متجانسة من أنواع الخلايا (الخلايا العصبية glutamatergic من طبقات مختلفة ، والخلايا العصبية المثبطة والخلايا الدبقية) باستخدام هذه الأساليب. استخدام electroporation في الرحم لإدخال الحمض النووي يبني في القشرة القوارض الجنينية يسمح لمجموعات فرعية معينة من الخلايا لتكون مستهدفة : في حين electroporation الجنينية المبكرة من القشرة أهداف الطبقات العميقة من القشرة ، electroporation في أواخر timepoints الجنينية أهداف طبقات أكثر سطحية. مزيد من موضع الفرق من الأقطاب الكهربائية عبر رؤساء نتائج الأجنة الفردية في استهداف المناطق الظهري البطني الإنسي مقابل الاطراف من القشرة. electroporation التالية ، يمكن تشريح الخلايا transfected الخروج ، فصل ، ومطلية في المختبر للتحليل الكمي لثمرة neurite. هنا ، ونحن نقدم أسلوب خطوة بخطوة لقياس الكمي العصبية ثمرة عملية في مجموعات فرعية من الخلايا القشرية.
وقد وصفت البروتوكول الأساسي للفي الرحم electroporation بالتفصيل في مقالين إن الرب الأخرى من المختبر Kriegstein 1 و 2. سوف نقدم لمحة عامة عن بروتوكول لدينا في الرحم electroporation ، مع التركيز على أهم التفاصيل ، يليه وصفا لدينا بروتوكول أن ينطبق في electroporation الرحم لدراسة وظائف الجينات في عملية نمو الخلايا العصبية.
Protocol
وقد وصفت البروتوكول الأساسي للفي الرحم electroporation بالتفصيل في مقال آخر إن الرب من المختبر Kriegstein 1 و 2. وقد وصفت هذه التقنية أصلا في 3 مختبر Osumi ويستند بروتوكول لدينا على واحدة وضعت في المختبر LoTurco 4. سوف نقدم لمحة عامة عن بروتوكول لدينا في electroporation الرحم للأجنة الفئران ، مع التركيز على أهم التفاصيل ، يليه وصفا لدينا بروتوكول أن ينطبق في electroporation الرحم لدراسة وظائف الجينات في عملية نمو الخلايا العصبية.
1. Electroporation في الرحم
- إعداد الحمض النووي وتحميل الإبر
الخطوة الأولى لelectroporations في الرحم هو تصميم تجربتك الحمض النووي لتحديد ما يبني تريد حقن. هذه الطريقة مفيدة لكلا misexpressing أو هدمت الجينات في المصالح. إذا كنت تخطط لجينة أو misexpressing overexpressing ، تأكد من استخدام المروج الذي ينشط في الخلايا العصبية السلائف. نوصي CAGGS المروج ، والذي يتكون من مروج بيتا أكتين الدجاج ومحسن CMV 5. لأن transfected فقط مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا باستخدام electroporation في الرحم ، فمن الأهمية بمكان أن تدرج ترميز البلازميد بروتين فلوري مثل GFP بحيث تتمكن من متابعة تلك الخلايا التي تم electroporated بنجاح. لترميز GFP البلازميد ، نوصي إعداد الحمض النووي عند تركيز قدره 0.5 ميكروغرام لكل ميكروليتر. ليبني shRNA ، وجدنا أن 0،5-1،0 ميكروغرام لكل ميكرولتر نتائج فعالة في إسقاط الجينات اهتمامك. لoverexpression أو misexpression ، ونحن نستخدم ما بين 1.0 و 3.0 ميكروغرام لكل ميكروليتر ، تبعا لحجم ومستوى الجينات التعبير التي تدعو إلى التجربة. وتعد السلطات الوطنية المعينة باستخدام طقم Qiagen الإعدادية خالية من الذيفان الداخلي ، والمخففة في برنامج تلفزيوني × 1. نحن ضخ حوالي 0،5-1،0 ميكرولتر في المخ الجنينية ، لذلك ، لفضلات الحيوانات نستعد 10 ميكرولتر من مزيج الحمض النووي للحقن. نضيف 1 ميكرولتر الخضراء سريعة على الحمض النووي بحيث يمكننا تتبع الحمض النووي حقن.
سحب الإبر إلى الشكل الصحيح هو خطوة حاسمة. Walantus آخرون يستخدم نظاما مختلفا لتقديم الحمض النووي وغير ذلك من إبرة الإعدادية هي أيضا مختلفة slighly 1،2 لنا ذلك الحين. والإعدادات التي يمكنك استخدامها لسحب الإبر الخاص يعتمد على نوع من إبرة مجتذب التي لديك. نستخدم الموديل 750 من Kopf ديفيد. الإعدادات التي نستخدمها هي : الحرارة 1 : 9.0 ، هيت 2 : 0 ، Soleniod : 0 ، الشعيرة حجم 3.0 ملم ، والقرب مسخن : 3 مم ، الوقت : 10 ثانية. وانسحب مرة واحدة ، وقطع لدينا نحن الإبر بشفرة حلاقة بزاوية 45 درجة ~ مثل هذه المسافة من الجزء الأكبر من الانفتاح على الطرف هو 11 ملم. نحن ثم تحميل الحمض النووي من نهاية الجزء الخلفي من الإبرة. ملأنا ثم المساحة المتبقية في الإبرة مع زيت الذرة. للحقن الحمض النووي ، ونستخدم Picospritzer الثالث. تبعا لشطبة الدقيق الذي يتم قطع لكل إبرة ، وضعنا Picospritzer 4،0-6،0. نستخدم دواسة القدم لتسليم الهواء المضغوط أن يطرد من الحمض النووي من الإبرة. - إعداد الحيوانات لإجراء عملية جراحية
نستخدم الممرض خالية سبراغ داولي الفئران حصرا لهذه الجراحات. مختبرات أخرى عديدة تستخدم الفئران من المورثات مختلفة كذلك. هنا ، نحن تصف تظهر لدينا بروتوكول للأجنة الفئران electroporation E15 ، ولكن في الرحم تتم بشكل روتيني electroporation في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين E13 E18 و. في حين أن المرحلة المبكرة electroporation أهداف الطبقات العميقة من القشرة ، electroporations مرحلة لاحقة تستهدف طبقات أكثر سطحية.
وتعطى جرعة والحيوانات قبل منطوق البوبرينورفين (،05-0،1 ملغ / كلغ) ، قبل ان يبدأ عملية جراحية. هناك خيارات متعددة للالتخدير الحيوان. Walantus آخرون يستخدم استنشاق isofuorane ، بينما نستخدم عادة الحقن داخل الصفاق الكيتامين (40-80 ملغ / كلغ) وزيلازين (5-10 ملغ / كلغ) 1،2. وينبغي دائما أن يؤديها قرصة إصبع لضمان أن يتم تخدير الحيوانات بشكل كامل وغير مستجيب. يتم الاحتفاظ الحيوانات على لوحة ساخنة طوال عملية جراحية.
غير حليق الفراء الحيوان في منطقة الشق ، وغسلها ثلاث مرات مع الإيثانول تليها ثلاث مرات مع اليود. يتم إجراء شق في الجلد الوحشي لمجرد خط الوسط ، تليها شق في العضلات. يتعرض أبواق الرحم بعناية فائقة. ومازحت بلطف لهم بالخروج من تجويف الجسم باستخدام أطراف أصابعك. إبقاء الأجنة رطب مع برنامج تلفزيوني العقيمة بينما هم خارج تجويف الجسم. - حقن الحمض النووي وelectroporation
عند بدء تشغيل أول إجراء هذه العمليات ، فإن الجزء الأصعب هو أن تصبح على دراية حيث كنت في حاجة لحقن الحمض النووي بحيث يمكنك ملء البطينين الوحشي ، والتعود على مدى عمق يحقن إبرة الخاص من أجل ضرب المنطقة الصحيحة. يتم التلاعب برفق مع أطراف أصابعك الأجنة بحيث يمكنك IDENTify حيث الرأس ، وإذا كنت تبحث عن كثب سوف تكون قادرا على رؤية خياطة خط الوسط. هذا بمثابة المعالم العامة التي يمكنك استخدامها لتحديد حيث يقع البطين الجانبي. نحن حقن الحمض النووي من خلال جدار الرحم وإلى البطين الجانبي. نستخدم footpedal للسيطرة على حقن الحمض النووي -- يتم تنفيذ البقول متعددة من الحمض النووي حتى يتم ملء البطين الجانبي مع الحمض النووي / خليط صباغة. ثم نضع أقطاب مجداف على جانبي رأس الجنين واستخدام آخر footpedal لتسليم النبض عبر رأس الجنين. موضع الأقطاب أمر حاسم في تحديد أي منطقة من القشرة هو electroporated. منذ مشحونة سلبا على الحمض النووي ، فإن الحمض النووي السفر باتجاه القطب الموجب عند بدد تهمة عبر المجاذيف. اعتمادا على الموضع الدقيق للأقطاب ، سوف تستهدف مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا. نحن عادة مكان بالقرب من القطب الموجب مواقف الظهري الإنسية عبر المخ. ومع ذلك ، فإن المختبر أظهرت LoTurco الجميلة التي لو كنت مكان الأقطاب في أكثر المناطق البطنية الجانبية للمخ يمكنك استهداف الخلايا من الخلايا القشرية الحدود وضرب الجسم المخطط ، من دفق القشري الجانبي 6. ويمكن لكل electroporated الجنين ، ويمكن استخدامها تركيبات مختلفة من الحمض النووي في كل يبني الجنين. - خياطة والرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية
electroporation التالية لجميع الأجنة ، يتم إرجاع بعناية قرون الرحم الى تجويف الجسم ، وتتم خياطة كل من طبقة العضلات والجلد. ويرد لهذا الأسلوب في Walantus آخرون 1،2. تتم مراقبة الحيوانات باستمرار حتى يشفى من التخدير ، وإدارة مسكن البوبرينورفين (،05-0،1 ملغم / كغم) كل 8-12 ساعة.
2. زراعة الخلايا العصبية Electroporated القشرية
- حصاد العقول electroporated وتشريح المنطقة electroporated
لالمجراة في التحليلات التالية في electroporation الرحم ، ويمكن حصادها الحيوانات في أي نقطة زمنية من 24 ساعة التالية لelectroporation في وقت مبكر بعد الولادة وحتى سن البلوغ. ومع ذلك ، عندما زرع الخلايا العصبية الأولية نحن حصاد 24 ساعة التالية electroporation في E16. في هذا الوقت ، والأجنة electroporated يعبرون عن المستويات التي يمكن اكتشافها من GFP.
يصرح باستخدامها الحيوانات استنشاق ثاني أكسيد الكربون باستخدام قطع الرأس والسريع. يتم تشريح أجنة خارج الرحم ، ووضعها في HBSS الكاتيونات مع ثنائي التكافؤ ، تتبع التي كانت electroporated الأجنة التي البلازميدات الحمض النووي. فمن الأهمية بمكان استخدام HBSS تصفيتها ، وأنابيب وألواح العقيمة ، لتعقيمها وأدوات تشريح. يتم تشريح قشرات خارج السحايا وإزالتها باستخدام المجهر في غطاء محرك السيارة. ولوحظت هذه القشور ثم تحت المجهر تشريح لديها القدرة على تصور GFP. ويتم تحديد المناطق GFP إيجابية من القشرة ، ونحن رق مقصا لقطع فانا المناطق GFP إيجابية من القشرة. توضع هذه القطع في HBSS دون الكاتيونات ثنائي التكافؤ في أنبوب مخروطي 15 مل. - الفصل بين الخلايا العصبية وتصفيح
حالما يتم تشريح جميع المناطق GFP إيجابية ، يتم استبدال التربسين HBSS مع 0.25 ٪ ، وحضنت في 37 درجة لمدة 5 دقائق. تتم إزالة التربسين ، استبدلت مع وسائل الاعلام الطلاء (+ 5 ٪ DMEM FBS + + الجلوتامين بنسلفانيا / بكتيريا) ، ومسحوق 5-7 مرات لفصل الخلايا. استخدام وحدات التخزين تعتمد على كمية من النسيج الحالي. ومطلي ثم تنفصل الخلايا عن CC2 الشرائح الغرفة المغلفة. للشرائح الغرفة اثنين ، ونحن لوحة 200،000-350،000 الخلايا لكل غرفة في حجم 1.5 مل من وسائل الاعلام الطلاء. بعد 4 ساعات ، والطلاء ، ويستنشق وسائل الاعلام مع وسائل الاعلام استبدال 1.5 مل الثقافة متعلق بالخلايا العصبية (Neurobasal وسائل الاعلام + + B27 تكملة glutamax + جنتاميسين) في القاعة.
3. تحليل ثمرة عملية متعلق بالخلايا العصبية
- تحديد والثقافات immunostaining
من أجل قياس effecs المدى القصير من التلاعب الجيني لهذه الخلايا ، ونحن حصاد الخلايا العصبية الأولية بعد ثلاثة أيام في المختبر. إذا الخلايا العصبية الأساسية هي أن يكون المثقف أطول لتحاليل إضافية ، ينبغي استبدال نصف وسائل الاعلام كل ثلاثة أيام. لتحديد الثقافات ، ونحن نضح وسائل الإعلام من الدوائر ، وتحديد الخلايا العصبية في paraformaldhyde 4 ٪ لمدة 15 دقيقة. تثبيت التالي ، يتم غسلها مرتين في الخلايا ومن ثم وضع برنامج تلفزيوني في عرقلة الحل (2 ٪ المصل حمار مع 0.1 ٪ تريتون X - 100 في برنامج تلفزيوني) لمدة ساعة. ثم يتم تحضين الخلايا في جسم الأولية لمدة 1 ساعة. لتحليل ثمرة عملية الخلايا العصبية ، ونحن استخدام الألغام المضادة للأجسام المضادة tubululin بيتا لتحديد الخلايا العصبية -- بيتا immunostaining تويولين الثاني تسميات خلايا الجسم neruonal ، التشعبات والمحاوير. ثم يتم غسل الخلايا ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق ، ثم في وحضنت Cy3 مكافحة الفأر لمدة 1 ساعة ، يليه ثلاثة يغسل PBS ، counterstaining النوى مع دابي والتركيب. - قياس شمال شرقurite طول
يتم الحصول على صور إيجابية GFP ، الخلايا العصبية تويولين بيتا الثالث إيجابي على Axioskop زايس مع نظام الكاميرا MC100. يمكن فحص عدة متغيرات في هذه الخلايا GFP إيجابية بما في ذلك طول كل neurites ، وطول أطول neurite ، المتفرعة من neurites ، وحجم الخلية سوما ، الخ لقد استخدمنا هذا الأسلوب لتحليل الخلايا العصبية ثمرة عملية هدم أو بناء على overexpression من الجينات المتصلة النمو العصبي وتنكس عصبي ، مع التركيز على طول عملية الخلايا العصبية. من أجل قياس العمليات ثمرة العصبية ، ونحن نستخدم Axiovision 4.4 جنيه البرمجيات (من زايس). في إطار هذا البرنامج ، هناك خيار لتحديد "الخطوط العريضة" الأداة. باستخدام هذه الأداة ، يمكنك استخدام فأرة الكمبيوتر الخاص بك لتتبع طول كل عملية الخلايا العصبية. فمن الأهمية بمكان لتحديد الهدف الذي تستخدمه من أجل الحصول على قياس دقيق لneurites الخاص. لهذه التحليلات ، ونحن نستخدم عادة هدفا 20X.
4. ممثل النتائج
لقد وجدنا أن حجم القمامة سبراغ داولي يتراوح ما بين 6 و 14 الأجنة. نحن عادة electroporate جميع الأجنة. يمكن electroporated كل جنين مع مجموعة مختلفة من السلطات الوطنية المعينة. ومع ذلك ، فإننا electroporate عادة لا يقل عن أربعة أدمغة مع نفس الحالة وتجمع هذه العقول قبل النأي والطلاء.
لقد وجدنا أنه مع هذه التقنية يتم استهداف ما يقرب من 75 ٪ من العقول electroporated إلى المنطقة المرجوة من القشرة ، سواء كان ذلك على القشرة الظهرية أو البطنية الجانبي الإنسي (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك ، لقد تم العثور على الخلايا العصبية في وقت مبكر electroporations الهدف E13 - 14 طبقة عميقة مثل Tbr1 إيجابية طبقة الخلايا العصبية السادس ، بينما في وقت لاحق electroporations CTIP2 الهدف إيجابية ، TBR1 الخامس طبقة الخلايا السلبية ، وبعد ذلك لا يزال الهدف electroporations Brn2 إيجابية الطبقة الثانية / الثالثة الخلايا. وجدت وصفا ممتازا من علامات مختلفة ، وشرح للمواصفات سلالة الخلايا العصبية في القشرة في مقال Moleneaux 7 آخرون. ويبين الشكل 2 المقاطع الاكليلية أدمغة electroporated إما في اليوم الجنينية 15.5 أو 17.5 في يوم وتحصد بعدها 5. هو مبين في الحمراء immunostaining لOct6. يمكنك immunostain للعلامات في الثقافة السكانية لتأكيد ما لديك طبقة الخلايا المستهدفة. لقد وجدنا أن هل يمكن أن نتوقع لاستهداف طبقة الخلايا نفسها من السكان في كل خلايا الجنين من القمامة نفسه (وبعبارة أخرى ، فإن استهداف يعتمد على timepoint جنينية بدلا ثم على الاختلافات الفنية الأخرى).
في الثقافة ، لا يمكن للفي المئة من الخلايا التي يتم GFP ايجابية اعتمادا على نطاق واسع النطاق بشأن كيفية المحافظة عندما كنت خارج المنطقة تشريح GFP إيجابية (الشكل 3). ومع ذلك ، حتى عندما نكون محافظين جدا وتشريح إلا من التصحيح GFP الإيجابية للخلايا ، وهي أعلى نسبة التي نلاحظها هي 5-10 ٪ -- على الرغم من أنك تشريح منطقة القشرة التي تم electroporated ، فإن الخلايا في طبقة واحدة فقط تكون مستهدفة. هذا effciency ترنسفكأيشن منخفضة مفيد في تحديد العمليات التي تنتمي إلى الخلية التي تقوم electoporated تحليل. في هذه الخلايا تصفيح أعلى كثافة يساهم في وجود heathier الثقافات ، ومع ذلك ، فإنه من الصعب تمييز أي عملية التي ينتمي إلى خلايا الجسم في الخلايا GFP السلبية (الشكل 3).
إذا كان لديك مشكلة في رؤية جميع العمليات الدقيقة للخلايا electroporated ، يمكنك إما زيادة تركيز الحمض النووي GFP أنك electroporating لزيادة التعبير عن GFP ، أو يمكنك immunostain فصل الخلايا باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة GFP (من Invitrogen ) جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة Cy2 الثانوية.
وelectroporated الشكل 1. E15.5 سبراغ داولي الفئران مع GFP البلازميد وحصادها بعد ثلاثة أيام. بناء على تنسيب من الأقطاب ، سوف تستهدف مناطق مختلفة من القشرة. AF تظهر في أدمغة GFP مضان كله.
الشكل 2. E15.5 (A) أو E17.5 (B) وelectroporated سبراغ داولي الفئران مع GFP البلازميد والحصاد في يوم ما بعد الولادة 5. تم إصلاح العقول ، مقطوع به coronally a vibratome (100 ميكرون المقاطع) ، وimmunostained لOct6 (الحمراء). A و B تظهر الصور مبائر أقسام immunostained.
وelectroporated الشكل 3. E15.5 سبراغ داولي الفئران مع GFP البلازميد. 24 ساعة التالية electroporation ، تم حصادها GFP العقول وإيجابية ، تم تشريح وفصل المناطق electroporated ، كما هو موضح في الفيديو. بعد 3 أيام في المختبر ، تم إصلاح الخلايا وimmunostained لbIII - تويولين (الحمراء) ، وتلطيخ النوى مع دابي (الأزرق) (A ، C). وقد تم قياس طول أطول neurite باستخدام البرمجيات Axiovision(B ، D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الدراسة في المختبر من الثقافات العصبية الأولية تسمح للتحليلات كمية من ثمرة neurite. من أجل دراسة كيفية تغيرات جينية تؤثر على الخلايا العصبية ثمرة عملية ، يمكن عرض أو shRNA misexpression يبني في الخلايا العصبية الأولية عن طريق ترنسفكأيشن الكيميائية أو تنبيغ الفيروسية. ومع ذلك ، مع الخلايا القشرية الأولية ، هي transfected مجموعة غير متجانسة من أنواع الخلايا (الخلايا العصبية glutamatergic من طبقات مختلفة ، والخلايا العصبية المثبطة والخلايا الدبقية) باستخدام هذه الأساليب. استخدام electroporation في الرحم لإدخال الحمض النووي يبني في القشرة القوارض الجنينية يسمح لمجموعات فرعية معينة من الخلايا لتكون مستهدفة : في حين electroporation الجنينية المبكرة من القشرة أهداف الطبقات العميقة من القشرة ، electroporation في أواخر timepoints الجنينية أهداف طبقات أكثر سطحية. مزيد من موضع الفرق من الأقطاب الكهربائية عبر رؤساء نتائج الأجنة الفردية في استهداف المناطق الظهري البطني الإنسي مقابل الاطراف من القشرة.
استهداف طبقات محددة :
عند حقن الحمض النووي في البطين الجانبي وelectroporate ، وتستهدف فقط الخلايا المبطنة على الفور venrtricle الجانبية : هذه الخلايا هي الخلايا الاصلية الدبقية شعاعي من القشرة المخية الحديثة ، فضلا عن الخلايا التي مرت للتو على الانقسام الطرفي. ومن المثير للاهتمام ، وعندما درست في الأيام التالية electroporation ، والخلايا المستهدفة تطابق نمط من الخلايا birthdated. وبعبارة أخرى ، والخلايا التي تولد ، وهذا يعني تلك التي تخضع لها محطة الانقسام في يوم electropoartion ، هي الخلايا التي هي المستهدفة. منذ الخلايا الدبقية شعاعي موجودة أيضا على السطح البطيني ، يمكن للمرء افتراض انه قد يتم استهداف هذه الخلايا ، والتي من شأنها أن تستهدف أيضا كل من سلالة من هذه الخلايا يمكن. ومع ذلك ، لم تكن هذه هي الحالة ، في وقت لاحق أجيال من الخلايا لا تعبر عن GFP. قد يكون ذلك جولات متعددة من الانقسام في الخلايا الدبقية شعاعي يخفف خارج البلازميد.
التطبيقات :
هذا الأسلوب هو وسيلة ممتازة لدراسة آثار الجينات نهدم عبر electroporation من contructs shRNA ، فضلا عن misexpression من يبني [كدنا]. نحن نطبق هذا techniqe لدراسة الجينات المسؤولة عن مرض تنكس عصبي ونفسي. من خلال هذه التقنية ، ونحن نقدم على حد سواء البرية وأشكال نوع من الجينات الطافرة حاسما في هذه الأمراض ، ودراسة الآثار المترتبة على مورفولوجيا الخلايا العصبية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن ندرس الآثار المترتبة على الطفرة أو بديلة التعبير البديل لصق في غياب منتج الجين المحلية التي شاركت في electroporating [كدنا] وcontruct shRNA. شارك في electorporation كما يمكن استخدامها للبحث في تفاعلات جينية بين الجين المنتجات هما : الجينات التي هدمت ومتعددة من خلال محاولة لانقاذ آثار نهدم من الجين المنتج مع منتجات أخرى الجينات 8 و 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر جوزيف LoTurco Selkoe ودينيس لإجراء مناقشات مفيدة حول هذه التقنية. المؤلفان بالشكر إلى الجهات المانحة لمساعدة مؤسسة الصحة الاميركية ، لدعم هذه البحوث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free) | GIBCO, by Life Technologies | 14185-052 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 ) | GIBCO, by Life Technologies | 14065-056 | |
| 1M HEPES pH 7.4 | GIBCO, by Life Technologies | 15630-080 | |
| 100 x 15 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 60 x 15 mm Petri Dishes | BD Biosciences | 351007 | |
| 15 mL conical vial | Sarstedt Ltd | 62-547-205 | |
| 50 mL conical vial | Sarstedt Ltd | 62-554-205 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| .25% Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Hand-Held Tally Counter | Sigma-Aldrich | Z169021 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-051 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| NEUROBASAL Medium | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| GlutaMAX -I Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| Gentamicin Reagent Solution | GIBCO, by Life Technologies | 15750-060 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| beta-III tubulin antibody | Chemicon International | MAB1637 | |
| MAP2 antibody | Chemicon International | AB15452 | |
| Donkey Cy3 anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 715-166-151 | |
| Donkey Cy2 anti-chicken | Jackson ImmunoResearch | 703-226-155 | |
| DAPI | GIBCO, by Life Technologies | D3571 | |
| CC2 Coated Two-Chamber Slides | Lab-Tek | 154852 | |
| Fluorescent Mounting Media | KPL Inc | 71-00-16 | |
| 24 x 60 mm Micro Cover Glasses | VWR international | 48393-106 | |
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | |
| buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | ||
| BTX square wave electroporator | Fisher Scientific | BTXECM830 | |
| Tweezertrodes, 7 mm, platinum | Harvard Apparatus | 450488 |
References
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).
- Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).
- Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain. Dev Neurosci. , 144-156 (2008).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference. J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1. Neural Develop. 3, 15-15 (2008).
