Summary
Taç bölgesi yüzeyinde HIV-1 zarf glikoprotein (gp120) farklı V3 döngü dizilerinin yapısal pozisyonları siliko katlama birçok durumda karakterize edilebilir bir state-of-the-art kullanarak döngü 10 ila 22
Abstract
HIV-1 antijenik çeşitliliğinin uzun aşı tasarımı için bir engel olmuştur ve bu değişkenliği, özellikle virüs yüzey zarf glikoprotein V3 döngü içinde telaffuz edilir. Biz daha önce V3 döngü taç rağmen, dinamik ve sıra değişken, HIV-1 virüs immünolojik ilgili bir β-saç tokası üçüncül yapısı nüfus boyunca kısıtlı olduğunu önerdi. Önemlisi, farklı V3 döngü taç dizileri binlerce kristalografisi veya NMR ile zor veya imkansız virüslerin çeşitlilik trendleri 3D yapısal karakterizasyonu, HIV-1 virüsleri vardır. Bizim daha önceki başarılı çalışmaları V3 taç 1, 2, katlama, ICM-Pro moleküler modelleme yazılım paketi (Molsoft LLC, La Jolla, CA) erişilebilir ab initio algoritması 3 kullanılan ve önerilen V3 döngü taç , özellikle 10 ila 22 pozisyonları, esneklik ve serbestçe çözüm katlanır kısıtsız bir peptid sanki büyük ölçüde davranmaya, yan gövde uzunluğu yeterince yararlanıyor. + 60,000 herhangi bir bireysel suşu V3 döngü sadece bu bölümü, hızlı ab initio katlama gibi dolaşan HIV-1 suşlarının bilgilendirici olabilir. Burada, R2 suşu V3 döngü eşsiz özellikleri yapısal olarak içgörü kazanmak için katlanmış. R2, hasta serumu ve monoklonal antikorlar, 4, 5 bu zorlanma nötralizasyon için bu hassasiyeti sorumlu olduğu düşünülen nadir bir V3 döngü sırası taşımaktadır. Zorlanma, CD4-bağımsız enfeksiyon aracılık ve nötralize edici antikorlar ortaya çıkarmak için geniş görünür. Biz katlama sonuçlarının değerlendirilmesi katlama gözlenen yapılar R2 gözlenen immünolojik faaliyetleri ile ilişkilendirmek için ne kadar bilgilendirici olabilir göstermektedir.
Protocol
1. Metodoloji
- Protokol siliko kat isteyen V3 taç sırasını seçmek için ilk adım. R2 gerginlik için, bu parça için sıra KSIPMGPGRAFYT.
- Bilgisayarın sanal uzayda bu sıra ilgili peptid 3D atomik yapı inşa edilmelidir. Bunun için ICM komut:
buildpep "KSIPMGPGRAFYT"
ya da Dosya: Yeni: Peptid aşağı çekme menüsü altında seçilebilir - Sonra arama adımları sayısı (arama süresi), simülasyon sıcaklığı, önyargı makul alanları, enerji açısından, farklı enerji hesaplama yöntemleri seçimi doğru arama değişken koltuk da dahil olmak üzere arama stratejisi parametreleri de dahil olmak üzere, prosedürün bazı parametreleri ayarlanır ve arama gibi bir film kaydetmek isteyip olarak kaydedilir ve kaç ara puanlama konformasyonlar nasıl belirten parametreler kayıt altına alınmalıdır. Tüm bu parametreler önceki yayınlar (www.molsoft.com bakınız) tarafından optimize edilmiştir.
- Katlama sonra komut ile başlatılır:
montecarlo
ya da Dosya: Yeni: Peptid menü Moleküler Mekanik aşağı çekme altında seçilebilir: Küçült: Küresel
Birinci durumda, 3. adımdan itibaren parametreler komut satırından tek tek ayarlanması gerekir. İkinci durumda komut çalıştırılmadan önce, en sık seçilen parametreler için onay kutularını bir bölmede sağlanmaktadır. Kolaylık sağlamak için, daha önce yayınlanan bu deneme ve deneyler için kullanılan aynı katlanır ICM komut dosyası aşağıda gösterilmiştir:
Bu komut dosyası, bir metin dosyasına kaydedilir ve hızlı bir şekilde komutunu kullanarak bilgisayara işletim sistemi komut satırı (genellikle LINUX) çalıştırmak olabilir:
icm _foldingscript
2. Başarı sırları
- V3 döngü uzunluğu neredeyse bilinen her türlü gerginlik sürekli bir 35 amino asitler, amino asit pozisyonları sistin gümrüklü kaynaklanan disülfit 1 ile başlayan ve 35 sistin gümrüklü ilgili disülfür ile sonlandıran 1 den 35 kadar numaralandırılmış. Bir döngünün parçası olduğundan, V3 taç sınırlarını dikkatle seçilmelidir. Özgür bir peptid sanki çok büyük bir parçası seçilirse, serbestçe esnek bir bölüm olarak davranmaya olası değildir, katlama simülasyon yapısını doğru değerlendirmek olmaz. Çok küçük bir parçası seçilirse, bilgilendirici üçüncül yapısı simülasyon form olmayabilir. Önceki çalışma pozisyonu 10 pozisyonu 22 parça antikor bağlı kristalografik konformasyonlar ile ilişkili olduğunu gösterdi, bu nedenle bu katlama seçilmelidir V3 herhangi bir döngünün parçası olduğunu.
- Grafik kullanıcı arayüzü kullanarak ve açılan menüler kullanıcı dostu olmasına rağmen, özellikle ICM ve V3 döngü taç katlama kullanarak, genel olarak peptid katlama önceden başarılı çalışmalar, sadece buildpep doğrultusunda sırasını değiştirerek ve çalışan, yukarıda kullanılan komut dosyası Yukarıdaki betik komut satırından tavsiye edilir.
3. Temsilcisi Sonuçlar
R2 katlama sonuçları herhangi bir V3 döngü için sonuçlar temsilcisi vardır. Sonuçlarını değerlendirmek için proje dosyası (Yukarıdaki betik "newProject1.icb" adlı olacaktır), seçilmiş "Moleküler Mekanik, Stack," açılmış ve olmalıdır. Yığını konformasyonlarının bir tablo belirecektir. Yığını konformasyonlar Arsa / Histogram simgesini tıklayarak grafiksel olarak görüntülenebilir. "Moleküler Mekanik, Stack, Play" görsel katlanarak ortaya çıkan konformasyonel tercihleri takdir yığının bir film yapacak. R2 dizisi için konformasyon V3 döngüler 2 için beklenen beta-saç tokası gibi pozisyonlarda parçası olarak, özellikle 12 ila 14 net bir β iplikli tercih yığın boyunca görülebilir ve çok az sayıda alfa sarmal konformasyonlar görülür. Ayrıca, yaklaşık 3 adet bir enerji açığı, düşük enerji uygunluğu ve ikinci en düşük enerji konformasyon arasında görülür. Enerjik bir noktadan itibaren, bu demektir ki en düşük enerji konformasyon yapısı sadece titriyor yüzde birden daha az zaman: katlama sonuçlar bu nedenle R2 V3 taç katı bir yerine, esnek, yapı olduğunu düşündürmektedir. Konformasyonlarının topluluk ek önemli yapısal özellikleri, ancak sistematik olarak takdir etmek zor olabilir.
| JRFL | SF162_V3JRFL | SF162_V3R2 | |
| 447 52d GMT 50 | 15 | 0,00061 | 0,00078 |
Tablo 1: JRFL ve R2 V3 Bağıl nötralizasyon maskeli ve maskesiz ayarları döngüler. Veriler daha önce Cardozo T., ve ark. ARHR (200 rapor edildi8) ve Pinter, A., ve ark. al J. Virol (2004). SF162_V3JRFL içeren JRFL: Kısaca, nötralize aktivite env-arızalı lusiferaz ifade JRFL Env veya yukarıda açıklanan SF162 V3 türevleri ile pseudotyped pNL4 3.Luc.RE-plazmid ile üretilen psVs kullanarak bir tek döngüsü enfektivite assay ile belirlendi SF162 V3 döngü sırası yerine V3 döngü sırası. SF162_V3R2 SF162 V3 döngü sırası yerine R2 V3 döngü sırası içerir. Polybrene (10 mg = ml) varlığında 96-kuyucuğu kaplama ° C, ve sonra CD4 + CCR5 + U87 hedef hücreleri psVs 37 az 1.5 saat süreyle 447-52d mAb seri dilüsyonları ile inkübe edildi. 24 saat sonra, hücreler inkübasyon ek bir 24-48 saat sonra% 10 FBS ve 10 mg = mL polybrene içeren RPMI medyum refed. Lusiferaz aktivitesi 447 52d% 50 nötralizasyon (GMT50) Promega, Inc geometrik ortalama titreleri tahlil reaktifler kullanarak mikrotiter plate luminometre (HARTA, Inc.) 48-72 saat postinfection tespit edildi nötralizasyon eğrileri interpolasyon tarafından belirlenir ve en az üç bağımsız testleri ortalamasıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ab initio katlama üçüncül yapısal özellikleri, bireysel amino asitler sırayla okuyan belirgin olmayabilir olan etkilerini ortaya koymaktadır. R2 V3 döngü taç önceden tanınmayan birçok yapısal özellikleri, katlama simülasyonu ile ortaya çıkar. Bu gözlenen yapısal tercihleri, yani R2 zorlanma, nötralizasyon ve hyperinfectivity 5 duyarlılık gözlenen fonksiyonel özellikleri ile ilişkili olabilir .
İlk olarak, pozisyonları 12-14 R2 V3 taç N-terminal yarı açık bir β iplikli eğilimi görülmektedir. Bu R2 suşu olağandışı izolösin-prolin-metiyonin (IPM) dizisi konumudur. V3 döngü peptidler, pozisyon V3 döngü 12 ila 14 bağlı olduğunda, bu antikorlar ile bağlı ve bağlı kristalografik 447-52d yapılar, 2219, Be48, 2557, 2558 ve 537-D anti-V3 döngü antikorlar, segment yerel bir β iplikli konformasyon benimser. Katlayan simülasyon böylece R2 V3 döngü taç bilinen anti-V3 döngü nötralize edici antikorlar tamamlayıcı 12 ila 14 pozisyonları bir konformasyon tercih ettiğini göstermektedir. Bu tercih, bu suşun nötralizasyon gözlenen hassasiyet açıklayabilir.
İkinci olarak, simülasyon, düşük enerji uygunluğu ve ikinci en düşük enerji konformasyon arasında 3 enerji birimleri, katı bir yapı düşündüren bir boşluk göstermektedir. HIV-1 gp120, bağlanmamış büyük bir konformasyonel kayması, formu (liganded), insan reseptör bağlı immünolojik (unliganded) formu korumalı ve immünolojik maruz gerektiren, son derece dinamik bir moleküldür. V3 döngü esneklik ile karşılaştırıldığında katı bir blok uzakta küçük bir boşluk içine sokun daha zor olabilir kadar, bu işbirliği geçiş efekti için gerekli ve sert R2 V3 döngü yapısı liganded formu değişen karşı gözlenen olabilir yumuşak, esnek bir blok. Unliganded formu benimseyerek Bu direnç V3 döngü, CD4 bağlanma yeri ve tüm karakteristik gp120 liganded formu maruz nötralizasyon epitoplar indüklenen CD4 maruz bırakabilir. Böylece, gözlenen bir katılık da kavramsal R2 suşu gözlenen nötralizasyon hassasiyetine bağlı olabilir.
V3 döngü şeklinde etkileşim eş-reseptör da nötralize edici antikorlar tarafından hedef formları gibi bir β-saç tokası olması muhtemel olduğundan, sonuçlar R2 V3 taç co-reseptör ve nötralize antikor tamamlayıcı formu kilitli olduğunu düşündürmektedir da son derece zorlanma enfektif, liganded forma, tüm gp120 teşvik edebilir. Böylece gözlenen konformasyonel tercihi ve sertlik, hem de kavramsal R2 hyperinfectivity ile ilişkili olabilir.
V3 döngü bir katı, ancak maruz co-reseptör ve antikor tamamlayıcı konformasyon Bu düzenleme, esnek bir farklı, ancak HIV suşlarının tipik V3 döngü gömülü ya da maskelenmiş. (Fikir birliği alt tip B, HIV-1 V3 döngü sırası sergiler) JRFL gerginlik katlanması da bir β iplikli tercihi, ancak V3 taç esneklik (veriler gösterilmemiştir) düşündüren çok yakından dağıtılan düşük enerji konformasyonlar gösterir. Tahmin maruz kaldığı yerine gömüldü bu V3 döngü dizisi 447 52d gibi uygun bir antikor tarafından nötralizasyon son derece duyarlı olacağını olurdu. Beklendiği gibi, V3 döngü JRFL veya R2 V3 döngüler (Tablo 1) yerini olduğu bir kimerik SF162 pseudovirus içinde maruz kalan bir ortamda sunulan JRFL ve R2 dizileri de aynı derecede hassas, ama aynı JRFL V3 döngü tamamen duyarsız. onun yerli JRFL bağlamında sunulduğunda nötralizasyon için.
Bu sonuçlar R2 suşu alışılmadık IPM dizisi katı bir antikor bağlayıcı site uyumlu, eş-reseptör-bağlayıcı yerinde V3 döngünün anahtar taç bölgede uyumlu şekli sağladığını göstermektedir. Katılık, büyük ölçüde V3 taç, eş-reseptör antikor optimal optimal şekli maruz kalan ve kullanılabilir liganded forma kilitleme, liganded ve unliganded formlar arasında geçişler gibi gp120 konformasyonel esneklik engel varsayımla. Sonuç nötralizasyon ve R2 suşu hyperinfectivity duyarlılık. Bu şekilde, bu protokolde tanımlanan ab initio katlama deneyi HIV aşısı araştırmaları için bilgilendirici burada R2 için gözlenen katlama sonuçlar, tercih edilen içine gp120 tabanlı immünojenler nasıl kilitlemek için bir ipucu olarak, HIV-1 aşısı immünojen tasarımı için önemli olabilir nötralizasyon duyarlı konformasyonlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
DP2 OD004631 ve R01 AI084119 dahil olmak üzere, Bill ve Melinda Gates Vakfı (38.631) ve NIH hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICM-Pro | Molsoft LLC |
References
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Zolla-Pazner, S. &, Cardozo, T. Dynamic characterization of the V3 loop crown. Antiviral Therapy. 12, 13-31 (2007).
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Swetnam, J., Zolla-Pazner, S., Cardozo, T. Structural conservation predominates over sequence variability in the crown of HIV type 1's V3 loop. AIDS Res Hum Retroviruses. 26, (2010).
- Abagyan, R., Totrov, M. Biased probability Monte Carlo conformational searches and electrostatic calculations for peptides and proteins. J Mol Biol. 235, 983-1002 (1994).
- Quinnan, G. V., Zhang, P. F., Fu, D. W., Dong, M., Alter, H. J. Expression and characterization of HIV type 1 envelope protein associated with a broadly reactive neutralizing antibody response. AIDS Res Hum Retroviruses. 15, 561-5670 (1999).
- Zhang, P. F., Bouma, P., Park, E. J. A variable region 3 (V3) mutation determines a global neutralization phenotype and CD4-independent infectivity of a human immunodeficiency virus type 1 envelope associated with a broadly cross-reactive, primary virus-neutralizing antibody response. J Virol. 76, 644-655 (2002).
