Summary
La région de couronne de différentes séquences de la boucle V3 de la glycoprotéine d'enveloppe de surface (gp120) du VIH-1 peut être structurellement caractérisé dans de nombreux cas dans le repliement in silico des positions 10 à 22 de la boucle à l'aide d'un état-of-the-art
Abstract
La diversité antigénique du VIH-1 a longtemps été un obstacle à la conception du vaccin, et cette variabilité est particulièrement prononcé dans la boucle V3 de la glycoprotéine du virus de surface de l'enveloppe. Nous avons déjà proposé que le sommet de la boucle V3, bien que variable dynamique et de la séquence, est contraint toute la population de virus VIH-1 à une immunologiquement pertinente β-épingle structure tertiaire. Surtout, il ya des milliers de séquences V3 différents couronne de boucles en circulation virus VIH-1, faire du 3D, caractérisation structurale des tendances à travers la diversité des virus difficiles, voire impossible, par cristallographie ou RMN. Nos études antérieures réussies avec le pliage de la couronne V3 1, 2 utilisé l'algorithme ab initio 3 accessibles à l'ICM-Pro package logiciel de modélisation moléculaire (Molsoft LLC, La Jolla, CA) et a suggéré que le sommet de la boucle V3, plus précisément de positions 10 à 22, suffisamment avantages de la flexibility et la longueur de ses tiges d'accompagnement de se comporter dans une large mesure comme s'il s'agissait d'un peptide sans contrainte librement pliage en solution. En tant que tel, le pliage rapide ab initio d'un peu de cette partie de la boucle V3 de toute souche individuelle des 60.000 + circulants souches VIH-1 peut être instructif. Ici, nous avons plié la boucle V3 de la souche R2 afin de mieux comprendre la base structurelle de ses propriétés uniques. R2 porte une séquence V3 rare boucle pensé pour être responsable de l'exquise sensibilité de cette souche à la neutralisation par les sérums des patients et les anticorps monoclonaux 4, 5. Les contraintes de médiateur CD4-indépendants infection et semble induire des anticorps neutralisants à large spectre. Nous montrent comment l'évaluation des résultats de pliage peut être informatif pour associer des structures observées dans le pliage des activités immunologiques observées pour R2.
Protocol
1. Méthodologie
- La première étape du protocole consiste à sélectionner la séquence couronne V3 vous voulez suivre in silico. Pour la souche R2, la séquence de ce fragment est KSIPMGPGRAFYT.
- La structure 3D atomique du peptide correspondant à la séquence doit être construit dans l'espace virtuel de l'ordinateur. La commande ICM pour cela est:
buildpep "KSIPMGPGRAFYT"
ou Fichier: Nouveau: Peptide peut être sélectionné sous le menu déroulant - Plusieurs paramètres de la procédure sont alors fixés, y compris le nombre d'étapes de recherche (durée de la recherche), la température de la simulation, les paramètres de stratégie de recherche y compris les restrictions variables pour solliciter la recherche vers les domaines de l'énergie, des termes raisonnables, le choix des différentes méthodes de calcul de l'énergie, et des paramètres indiquant comment la recherche sera enregistré comme celles consistant à enregistrer un film et combien de conformations intermédiaires de notation devraient être enregistrées. Tous ces paramètres ont été optimisés par previoNous publications (voir www.molsoft.com).
- Le pliage est alors lancé avec la commande:
montecarlo
ou Fichier: Nouveau: Peptide peuvent être sélectionnés dans le cadre de la liste déroulante du menu Mécanique Moléculaire: Minimiser: Global
Dans le premier cas, les paramètres de l'étape 3 doit être réglé une par une dans la ligne de commande. Dans ce dernier cas, les cases des paramètres les plus couramment sélectionnés sont prévus dans un panneau avant de la commande est exécutée. Pour plus de commodité, le même scénario pliage ICM utilisé pour cette expérience et des expériences déjà publiées est montré ici:
Ce script peut être sauvegardée dans un fichier texte et exécuté en ligne de l'ordinateur de commande du système d'exploitation (généralement LINUX) rapidement en utilisant la commande:
icm _foldingscript
2. Les secrets du succès
- La boucle V3 est une constante 35 acides aminés de longueur à peu près chaque souche connue, si l'acide aminé positions sont numérotés de 1 à 35 en commençant par le disulfure de cystine originaires lié à 1 et se terminant avec le disulfure de cystine liés correspondant à 35. Comme il fait partie d'une boucle, les limites de la couronne de V3 doit être soigneusement choisi. Si un trop grand fragment est choisie, il est peu probable de se comporter comme un segment librement flexible comme s'il s'agissait d'un peptide libre, de sorte que la simulation de pliage sera pas évalué correctement la structure. Si un trop petit fragment est choisie, la structure informative tertiaire peut pas se former dans la simulation. Notre étude préalable a montré que le fragment de la position 10 à la position 22 en corrélation avec d'anticorps liés conformations cristallographiques, si ce n'est le fragment d'une boucle V3 qui devrait être choisi pour le pliage.
- Bien que l'utilisation de l'interface utilisateur graphique et des menus déroulants est conviviale, le travail préalable avec succès sur le repliement des peptides en général en utilisant l'ICM et la boucle V3 de la couronne déployante en particulier utilisé le script ci-dessus, il suffit de modifier le séquençagee dans la ligne buildpep et l'exécution du script ci-dessus à partir de la ligne de commande est recommandée.
3. Les résultats représentatifs
Les résultats pour le pliage R2 sont représentatifs des résultats d'une boucle V3. Pour évaluer les résultats, le fichier projet (il sera nommé "newProject1.icb" dans le script ci-dessus) doit être ouvert et "Mécanique moléculaire, Stack, Voir« choisi. Un tableau des conformations de pile apparaît. Les conformations de pile peut être visualisé graphiquement en cliquant sur l'icône Terrain / histogramme. "Molecular Mechanics, Stack, Lecture" va faire un film sur la pile pour apprécier visuellement les préférences conformationnelles découverts par le pliage. Pour la séquence R2, la conformation est la bêta-épingle à cheveux comme prévu pour V3 boucles 2 - en particulier dans le fragment dans des positions 12 à 14, où une nette préférence β-brin est vu à travers la pile, et très peu de conformations en hélice alpha on voit. En outre,un intervalle d'énergie de près de 3 unités est observée entre la conformation de plus basse énergie et de la conformation de l'énergie le plus bas secondes. D'un point de vue énergétique, cela signifie que la structure ne scintille sur la conformation de plus basse énergie de moins d'un pour cent du temps: les résultats pliantes suggèrent donc que la R2 V3 couronne est une surface rigide, plutôt que flexible, la structure. Il peut y avoir d'autres caractéristiques structurelles importantes dans l'ensemble de conformations, mais ils sont difficiles à apprécier systématiquement.
| JRFL | SF162_V3JRFL | SF162_V3R2 | |
| 447-52D GMT 50 | 15 | 0,00061 | 0,00078 |
Tableau 1: neutralisation relative des JRFL et R2 V3 boucles en milieu masquées et non masquées. Les données ont été précédemment rapporté dans Cardozo T., et al. ARHR (2008) et Pinter, A., et al. al J. Virol (2004). En bref, une activité neutralisante a été déterminée avec un seul cycle de contrôle de l'infectiosité en utilisant VAL générés avec l'env-défectueuse luciférase exprimant pNL4-3.Luc.RE plasmide pseudotypés avec la Env JRFL ou les variantes SF162 V3 décrites ci-dessus: SF162_V3JRFL contient le JRFL séquence en boucle V3 à la place de la séquence de la boucle V3 SF162. SF162_V3R2 contient la séquence de la boucle V3 R2 à la place de la séquence de la boucle V3 SF162. Les PSV ont été incubées avec des dilutions successives de l'anticorps monoclonal 447-52D pour 1,5 h à 37 ° C, puis ajouté à CD4 + CCR5 + U87 cellules cibles immatriculés dans des plaques 96 puits en présence de polybrène (10 mg = mL). Après 24 heures, les cellules sont réalimentées par du milieu RPMI contenant 10% de FBS et 10 mg = ml de polybrène, suivie par un supplément de 24-48 heures d'incubation. L'activité luciférase a été déterminée 48-72 h après avec un luminomètre plaque de microtitration (HARTA, Inc) en utilisant des réactifs de dosage de Promega, Inc moyenne géométrique des titres pour neutralizat 50%ion (GMT50) 447-52D par ont été déterminées par interpolation à partir des courbes de neutralisation et sont des moyennes d'au moins trois essais indépendants.
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Discussion
Pliage ab initio révèle tertiaires propriétés structurelles, dont les effets peuvent ne pas être évident d'après l'étude individuelle des acides aminés de manière séquentielle. Plusieurs précédemment obscures propriétés structurales de la couronne R2 boucle V3 sont révélées par la simulation de pliage. Ces préférences observées structurelles observées peut corréler avec les propriétés fonctionnelles de la souche R2, à savoir la sensibilité à la neutralisation et hyperinfectivity 5.
Tout d'abord, une nette tendance β-brin dans la moitié N-terminale de la couronne V3 R2 à des positions 14.12 est observée. C'est l'emplacement de la souche inhabituelle R2 isoleucine-proline-méthionine (IPM) séquence. Des structures cristallographiques de la 447-52D, 2219, BE48, 2557, 2558 et 537-D anticorps anti-boucle V3 liés à des peptides boucle V3, les positions 12 à 14 de la boucle V3 sont liés par ces anticorps, et, quand il est lié, le segment adopte une β-brin locale conformation. La simulation de pliagetion suggère donc que la boucle V3 R2 couronne préfère une conformation en des positions 12 à 14 qui est complémentaire d'anticorps connus boucle V3 anti-neutralisation. Cette préférence peut expliquer la sensibilité observée à la neutralisation de cette souche.
D'autre part, la simulation montre un écart de 3 unités d'énergie entre la conformation de plus basse énergie et la conformation de l'énergie le deuxième plus bas, ce qui suggère une structure rigide. Gp120 du VIH-1 est une molécule extrêmement dynamique, qui exige un changement de conformation de son grand délié, immunologiquement protégés (sans ligand) forme à son récepteur humain lié et immunologiquement exposée (ligandé) forme. La flexibilité de la boucle V3 peut être nécessaire pour effectuer cette transition coopérative, et la structure rigide R2 boucle V3 observé ici peut résister à délaisser la production de la forme ligandé, un peu comme un bloc rigide pourrait être plus difficile à ranger dans un petit espace par rapport à un bloc mou souple. Cette résistance à l'adoption du sans ligandforme peut exposer boucle V3, les CD4 site de liaison CD4 et épitopes de neutralisation induits, qui sont tous exposés caractéristique sous la forme d'ligandé gp120. Ainsi, la rigidité observée peut également être conceptuellement relié à la sensibilité observée neutralisation de la souche R2.
Depuis le co-récepteur interagissant forme de la boucle V3 est également susceptible d'être un β-épingle à cheveux comme les formes ciblés par des anticorps neutralisants, les résultats suggèrent que la couronne R2 V3 est verrouillé dans le formulaire d'anticorps co-récepteur et de neutralisation complémentaire, qui à son tour, peut favoriser la gp120 entière dans sa forme ligandé, ce qui rend la souche hautement infectieuse. Ainsi, la préférence conformationnelle et la rigidité observée à la fois peut également être conceptuellement associée à hyperinfectivity R2.
Cette disposition d'une conformation rigide, mais exposée co-récepteur et un anticorps complémentaire de la boucle V3 est distinct de celui d'un flexible, mais enterrés ou masboucle V3 ked qui est typique des souches de VIH. Pliage de la souche JRFL (qui présente le sous-type B du VIH consensus-1 séquence boucle V3) montre également une préférence β-brin, mais de nombreux étroitement distribués conformations de plus basse énergie évocateurs d'une couronne de flexibilité V3 (données non présentées). La prédiction serait que cette séquence de la boucle V3 serait très sensible à la neutralisation par un anticorps approprié comme 447-52D si elle était exposée au lieu de enterrées. Comme prévu, les séquences JRFL et R2 sont également sensibles lorsqu'elles sont présentées dans un cadre exposé dans une chimère SF162 pseudovirus dans laquelle la boucle V3 est remplacé par JRFL ou R2 boucles V3 (tableau 1), mais la boucle V3 même JRFL est totalement insensible à la neutralisation lorsqu'il est présenté dans son contexte JRFL natif.
Ces résultats suggèrent que la séquence IPM inhabituelle de la souche R2 confère une rigidité, des anticorps du site de liaison compatible, co-récepteur du site de liaison forme compatible dans la région de la couronne clé de laLa boucle V3. La rigidité est supposé faire obstacle à la flexibilité conformationnelle de la gp120 comme les transitions entre les formes ligandé et sans ligand, en le bloquant en grande partie dans sa forme ligandé où l'anticorps optimal, co-récepteur-forme optimale de la couronne V3 est exposée et disponible. Le résultat est la sensibilité à la neutralisation et de la souche hyperinfectivity R2. De cette façon, l'expérience ab initio pliage décrites dans le présent protocole est instructif pour la recherche de vaccins VIH: les résultats observés pour pliantes R2 ici peut être important pour le VIH-1 de conception immunogène vaccin comme un indice pour savoir comment verrouiller la gp120 à base de immunogènes dans préférée conformations neutralisation sensibles.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Le travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Bill et Melinda Gates (# 38631) et le NIH, y compris OD004631 DP2 et R01 AI084119.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICM-Pro | Molsoft LLC |
References
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Zolla-Pazner, S. &, Cardozo, T. Dynamic characterization of the V3 loop crown. Antiviral Therapy. 12, 13-31 (2007).
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Swetnam, J., Zolla-Pazner, S., Cardozo, T. Structural conservation predominates over sequence variability in the crown of HIV type 1's V3 loop. AIDS Res Hum Retroviruses. 26, (2010).
- Abagyan, R., Totrov, M. Biased probability Monte Carlo conformational searches and electrostatic calculations for peptides and proteins. J Mol Biol. 235, 983-1002 (1994).
- Quinnan, G. V., Zhang, P. F., Fu, D. W., Dong, M., Alter, H. J. Expression and characterization of HIV type 1 envelope protein associated with a broadly reactive neutralizing antibody response. AIDS Res Hum Retroviruses. 15, 561-5670 (1999).
- Zhang, P. F., Bouma, P., Park, E. J. A variable region 3 (V3) mutation determines a global neutralization phenotype and CD4-independent infectivity of a human immunodeficiency virus type 1 envelope associated with a broadly cross-reactive, primary virus-neutralizing antibody response. J Virol. 76, 644-655 (2002).
