Summary
这个协议描述为微米级的三维成像在活细胞的电子自旋共振显微镜直接环境氧浓度的方法。
Abstract
这个协议描述三维映射与微米级的分辨率1活细胞的直接环境中的氧含量的电子自旋共振（ESR）显微成像方法。氧气是在生命周期中最重要的分子之一。它作为在线粒体氧化磷酸化的终端电子受体和用于生产活性氧。氧气测量是很重要的线粒体和代谢功能，信号转导通路，各种刺激的影响，细胞膜的通透性，和疾病的分化的研究。耗氧量，因此，细胞的新陈代谢，这是广泛适用于各种生物系统对整个生物体的细胞线粒体的信息标记。由于其重要性，有很多方法被开发为氧气的测量实时系统。主要是根据当前的尝试，提供高分辨率的氧成像光学荧光和磷光方法，未能提供令人满意的结果，因为他们采用高光毒性和含氧量低灵敏度的探测器。血沉增快，措施，从外源性样品中顺磁探头的信号，被称为氧气的浓度，以提供非常精确的测量。在一个典型的案例，ESR测量地图探头的线型扩大和/或松弛时间缩短，直接链接到当地的氧气浓度。 （氧是顺磁性，因此，外生顺磁探头碰撞时，急促的弛豫时间。）传统上，这些类型的实验与分辨率低，毫米波规模小动物成像的ESR。在这里，我们将展示如何ESR成像还可以进行微米级的小活标本的检查。 ESR的显微成像是一个相对较新的方法，使收购接近室温 2 1微米的分辨率与空间分辨ESR信号。本议定书的文件的主要目的是为了表明，这种新方法，随着新开发的氧敏感探头，可以适用于小活样品中的氧含量的映射。一个空间分辨率〜30 × 30 × 100微米证明，与附近的微摩尔的氧气浓度的敏感性和分飞摩尔每个体素的绝对氧敏感性。氧细胞附近的映射使用的ESR显微成像补充基于微电极或荧光/磷光目前可用的技术。此外，适当的顺磁探头，它也将很容易地适用于细胞内的氧气显微成像，能力等方法发现很难实现。
Protocol
1。 ESR的显微成像概述
首先，我们提供一个简要的解释的ESR，血沉显微镜，和我们的系统的各个组成部分，然后我们将描述实际的成像实验。
电子自旋共振光谱技术中，在特定频率的电磁辐射吸收与未成对电子的自旋的分子，放在下一个外部的静磁场（图1）。 ESR是在广泛领域的科学，如化学，生物，物理，材料科学，聘用，自由基与顺磁中心的检测和鉴定。它是一种顺磁性分子在活体物种的研究环境的强大方法，并提供有关酸度（PH），粘度，氧和活性氧浓度 3的信息。
异构样品，ESR光谱信息，可以得到在空间分辨的方式（即通过获取图像），通过利用磁场梯度 4 。这是非常相似的核磁共振成像（MRI），更常用的方法主要是观察质子的自旋。截至目前为止，如ESR成像技术被应用于几厘米的规模比较大的，在毫米级分辨率的活标本。 （例如，参见图2，参考文献5。）ESR成像较近期的发展寻找小动物在毫米级分辨率毫米波和亚毫米大小的样品测量其功能扩展微米级的分辨率。此字段被称为ESR显微镜，今天可以提供三维ESR的图像接近1微米（参见图3中的有代表性的例子）的决议。
ESR的显微镜是一个传统的ESR光谱仪基本相似。它有一个产生静电场，一个微波系统的自旋激发和信号检测，拿着样品探头，和一个计算机化的控制台来控制采集过程和数据处理的磁铁。其他元件独特的ESR成像和现有的ESR microcopy也梯度磁场源，是电子系统的一部分，和梯度线圈，成像探头位于。我们的特定系统的显示更多的细节在协议中的电影和参考文献2中所述。
2。 ESR显微成像样品制备
这一阶段描述的ESR显微成像实验样品制备方法。在这个阶段的细胞结束被放置在一个专门准备的玻璃ESR镜样品容器的底部，连同一个三苯甲基自由基6缓冲液。本协议描述了测量蓝藻细胞，因此，对于其他类型的细胞，适当调整可能需要在样品制备阶段。
- 首先，几个平方〜400 400微米大小的吸水纸，并插入到Eppendorf管中，随后充满蓝藻悬浮1.2毫升（浓度40毫克/毫升）。
- 停牌是在6000转速在微量离心2分钟。
- 在此之后，上清缓冲区完全删除除外〜50μL左避免蓝藻脱水。作为这一进程的结果，现在是饱和的吸水纸蓝藻细胞。
- 用细镊子，少数纤维是从文件中提取并置于杯专门准备的玻璃样品架7底部。以下3 BG - 11解决方案8，9毫米的三苯（见图1）添加罚款注射器援助样品架。持有人，然后采用紫外光固化胶密封，留下一个小风口开放。
库存4 股票3 股票2 库存1 H 3 BO 3
2.86g/literK 2 HPO 4：3H 2 O
4.0g/liter硫酸镁 ： 7H 2 O
7.5g/liter那2毫克 EDTA 0.1g/liter MnCl 2：4H 2 O
1.81g/liter铁铵柠檬酸0.6g/liter 硫酸锌：7H 2 O
0.222g/liter柠檬酸：1H2O
0.6g/liter4：硫酸铜5H 2 O
0.079g/liter氯化钙2 · 2H 2 O
3.6g/literCOCl 2 ：· 6H 2 O
0.050g/literNaMoO 4 · 2H 2 O
0.391g/liter
计划1。BG - 11培养基的制备。
3。 ESR显微成像实验
- 要开始了成像实验，打开的ESR显微成像系统和谐振器内成像探头插入样品。
- 现在，使用计算机控制软件，设置系统的“调教”模式，并找到共振微波频率的探头，将使用的ESR测量。
- 以下的价值相匹配应用的微波频率，设置静态磁场，脉冲序列的时序参数和观察的ESR信号，以确保系统的功能和样品是精心准备。
- 然后，将成像参数，如像素数，梯度的力量，和其所需的值的梯度脉冲的长度。
- 以下设置，收集interpulse分离，价值观500，600，700 NS一个哈恩回波成像脉冲序列（图4）三个ESR的3D图像。
- 样品投射灯是根据所需的实验条件下打开或关闭。
- 在收购过程中，数据将自动保存。这些原始数据文件，然后通过Matlab软件脚本提供的三苯甲基自由基浓度和弛豫时间T 2的地图，这是翻译成通过现有的预校准的氧气浓度形象的图像处理。
4。代表性的成果
实验的结果是几个记录在不同的τ值的三维ESR微图像。图5典型的原始数据图像。前三名的图像，在黑暗条件下测得，除了在减少信号强度非常相似。另一方面，光线照射下的图像格局的变化，由于在不同部位的样品的不同的弛豫时间。此数据可处理1获得振幅图像，如图6所示和弛豫时间 T 2（图7）的图像。 T 2图像转化为通过一个预先存在的校准曲线，链接通过方程的弛豫时间的氧气浓度的氧浓度值： 
在这里，T 2 0探头的自旋弛豫时间在缺氧条件下（取决于探头的浓度，C和它的扩散系数D），k是比例常数。在大多数情况下，扩散系数不变化为生活样本（虽然，如果需要的话，它可以在原则上可以直接评估也由ESR 6，10），并在成像过程中获得的自旋浓度。因此，这种关系可用于直接测量氧气浓度。
回到图6，它是显而易见的，从幅度图像，蓝藻的细胞主要位于右侧的样品架。此外，根据图7，它是明确的，光启动生产的O 2，导致在该解决方案的O 2浓度显着增加，主要是在附近的蓝藻的体素。
图1：电子自旋共振的能量水平。
图2：典型的氧气浓度对荷瘤鼠的形象。左边的图像显示的解剖信息，根据MRI图像。一个稳定的有机自由基注入鼠标和ESR特性提供了在其环境中的氧气浓度（右）。 ESR为基础的结果MRI解剖图像上叠加。视场是32毫米。
图3：高分辨率的微观尺度ES的两个例子ř图像的光刻生成N @ C 60的粉末（左）和LIPC顺磁性晶体样品（右）
图4：典型的哈恩成像脉冲序列显示微波（MW）和梯度，G X，G y和g ž脉冲。
图5：典型的原始数据ESR的微观图像：A，B和C为τ= 500600700 NS，分别测量没有光照的蓝藻样品的原始数据。项目D，E，并为A，B和C，但光照相同。强度是绘制在任意规模（但在每3个或深或浅的原始数据图像的设置一致）
图6：相应的解决方案中的自由基浓度（任意缩放）幅图像。
图7：T 2图像和相应的[O 2]暗（左）和光（右）的条件下的值。
Discussion
此协议表明如何ESR的显微成像可以应用到地图氧浓度附近居住的小样本。一个空间分辨率〜30 × 30 × 100微米证明，与附近的微摩尔的氧气浓度的敏感性和分飞摩尔每个体素的绝对氧敏感性。氧细胞附近的映射使用的ESR显微成像补充基于微电极或荧光/磷光目前可用的技术。此外，适当的顺磁探头，它会很容易地适用于细胞内的氧气显微成像，能力等方法发现很难实现。在不久的将来，我们计划进一步改进这种方法，提供活的样本图像，几微米的分辨率，提供对比参数，如超氧化物浓度，酸度（PH），探头的扩散系数，当然，氧气浓度。这些功能是相辅相成的对比类型和样本特征（非透明如厚样品，并在某些情况下，细胞内与外的测量）到目前的光学方法。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
部分支持这项工作是由格兰特没有。 213/09从以色列科学基金会，授予没有。 2005258从BSF的基础上，授予没有。 201665从欧洲研究委员会（ERC），由罗素Berrie在Technion工业的纳米技术研究所。我们承认Schulich商学院在Technion工业有关的供应和处理蓝藻的化学教授诺姆ADIR和法里斯萨拉梅的帮助。 Technion工业微纳米加工单位的帮助和支持斯韦特兰娜Yoffis是极大的赞赏。Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Kendro | Heraus, 75003235 | |
| Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical | Novosibirsk | Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6. | |
| BG-11 buffer | For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9. | ||
| Syringe | Hamilton Co | Microliter 7000.5 | |
| Ultraviolet Curing | Norland Products, Inc. | NOA63, or NOA61. |
References
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