Summary
Ce protocole décrit une méthode pour l'échelle du micron imagerie en trois dimensions de la concentration d'oxygène dans l'environnement immédiat des cellules vivantes par microscopie résonance de spin des électrons.
Abstract
Ce protocole décrit une résonance de spin électronique (ESR) de micro-imagerie méthode pour la cartographie en trois dimensions des niveaux d'oxygène dans l'environnement immédiat des cellules vivantes présentant de l'échelle du micron de résolution 1. L'oxygène est l'une des molécules les plus importants dans le cycle de vie. Il sert de l'accepteur d'électrons terminal de la phosphorylation oxydative dans les mitochondries et est utilisé dans la production d'espèces réactives de l'oxygène. Les mesures de l'oxygène sont importants pour l'étude des fonctions mitochondriales et métaboliques, les voies de signalisation, les effets de différents stimuli, perméabilité de la membrane, et la différenciation de la maladie. La consommation d'oxygène est donc un marqueur informatif du métabolisme cellulaire, qui est largement applicable à divers systèmes biologiques à partir des mitochondries dans les cellules d'organismes entiers. En raison de son importance, de nombreuses méthodes ont été développées pour les mesures de l'oxygène dans les systèmes de vivre. Les tentatives actuelles pour fournir l'oxygène d'imagerie à haute résolution sont essentiellement basées sur la fluorescence optique et les méthodes de phosphorescence qui ne fournissent pas de résultats satisfaisants car ils emploient des sondes avec photo-toxicité et une sensibilité élevées en oxygène est faible. ESR, qui mesure le signal provenant de sondes paramagnétiques exogènes dans l'échantillon, est connu pour fournir des mesures très précises de la concentration en oxygène. Dans un cas typique, les mesures ESR carte élargissement LineShape de la sonde et / ou de détente en temps le raccourcissement qui sont directement liés à la concentration en oxygène local. (Oxygène est paramagnétique, par conséquent, en cas de collision avec la sonde paramagnétique exogènes, c'est la brièveté de son temps de relaxation). Traditionnellement, ces types d'expériences sont réalisées à faible résolution, l'échelle millimétrique ESR pour l'imagerie des petits animaux. Nous montrons ici comment ESR imagerie peuvent également être effectuées dans le micron-échelle pour l'examen de petits échantillons vivants. ESR de micro-imagerie est une méthodologie relativement nouvelle qui permet l'acquisition de signaux résolus spatialement ESR avec une résolution voisine de 1 micron à 2 température ambiante. L'objectif principal de ce protocole-papier est de montrer comment cette nouvelle méthode, avec récemment développé des sondes sensibles à l'oxygène, peuvent être appliquées à la cartographie des niveaux d'oxygène dans de petits échantillons vivants. Une résolution spatiale de ~ 30 x 30 x 100 um est démontré, avec une sensibilité quasi-micromolaires concentration en oxygène et sous-femtomoles sensibilité à l'oxygène absolue par voxel. L'utilisation de l'ESR de micro-imagerie pour la cartographie de l'oxygène à proximité de cellules complète les techniques actuellement disponibles à base de micro-électrodes ou de fluorescence / phosphorescence. Par ailleurs, avec la sonde paramagnétique appropriée, il sera aussi facilement applicables pour l'oxygène intracellulaire de micro-imagerie, une capacité qui trouvent d'autres méthodes très difficile à réaliser.
Protocol
1. Aperçu de l'ESR de micro-imagerie
D'abord, nous donner une brève explication de l'ESR, la microscopie ESR, et les différentes composantes de notre système, puis nous décrirons les expériences d'imagerie réelle.
Résonance paramagnétique électronique est une technique spectroscopique dans lequel le rayonnement électromagnétique à une fréquence spécifique est absorbée par les molécules avec des spins des électrons non appariés, placé sous un champ magnétique externe statique (figure 1). ESR est employé dans de vastes domaines de la science, comme la chimie, la biologie, la physique et la science des matériaux, pour la détection et l'identification des radicaux libres et des centres paramagnétiques. C'est une méthode puissante pour étudier l'environnement de molécules paramagnétiques d'espèces vivent et fournit des informations sur l'acidité (pH), la viscosité, d'oxygène et d'espèces réactives d'oxygène concentrations 3.
Pour les échantillons hétérogènes, ESR informations spectrales peuvent être obtenus d'une manière résolue spatialement (ie, par l'obtention d'une image), grâce à l'utilisation des gradients de champ magnétique 4. Ceci est très similaire à la méthode plus commune de l'imagerie par résonance magnétique (IRM) qui observe principalement des spins des protons. Jusqu'à maintenant, ces techniques d'imagerie RPE ont été appliquées pour les spécimens vivants de la taille relativement grande de quelques centimètres et en millimètres échelle résolution. (Par exemple, voir la figure 2, tirée de la référence 5.) Un développement relativement récent dans l'imagerie ESR est l'extension de ses capacités en regardant les petits animaux à l'échelle millimétrique résolution à la mesure des échantillons millimétriques et submillimétriques-size avec l'échelle du micron résolution. Ce champ est connue comme la microscopie ESR, qui aujourd'hui peuvent fournir des images 3D ESR avec une résolution voisine de 1 micron 2 (voir des exemples représentatifs de la figure 3).
Un microscope ESR est essentiellement similaire à un spectromètre RPE conventionnelle. Il a un aimant pour générer le champ statique, un système de micro-ondes pour l'excitation de spin et de détection de signal, une sonde pour la tenue de l'échantillon, et une console informatisée pour contrôler le processus d'acquisition et de traitement des données. D'autres composants uniques de l'imagerie en général et ESR existantes également en microscopie ESR sont magnétiques sources gradient de champ, qui font partie du système électronique, et des bobines de gradient qui sont situés dans la sonde d'imagerie. Plus de détails sur notre système spécifiques sont présentés dans le film du protocole et décrit dans la référence 2.
2. Préparation ESR exemples de micro-imagerie
Cette étape décrit la méthode pour la préparation des échantillons pour l'ESR de micro-imagerie expérience. A la fin de cette étape de cellules sont placées sur le fond d'un conteneur spécialement préparé ESR échantillon de verre de microscopie avec un trityle radicale 6 solution tampon. Ce protocole décrit la mesure de cellules de cyanobactéries, et donc, pour d'autres types de cellules, les ajustements appropriés peuvent être nécessaires au stade de la préparation de l'échantillon.
- Tout d'abord, quelques carrés de papier absorbant avec une taille d'environ 400 400 um sont prises et inséré dans un tube Eppendorf qui est ensuite remplie de 1,2 ml de la suspension de cyanobactéries (à une concentration de 40 mg / ml).
- La suspension est centrifugée pendant 2 minutes à 6000 RPM dans une microcentrifugeuse.
- Suite à cela, le tampon surnageant est complètement enlevée, sauf pour ~ 50 uL qui sont à gauche pour éviter la déshydratation des cyanobactéries. En conséquence de ce processus, le papier absorbant est maintenant saturé par les cellules de cyanobactéries.
- En utilisant une pince à épiler fine, quelques fibres sont extraites du papier et placés sur le fond d'une coupelle porte-verre échantillons préparés spécialement 7. Après qu'un mm 3 de trityle dans BG-11 solution de 8, 9 (voir schéma 1) est ajouté au porte-échantillon à l'aide d'une seringue fine. Le titulaire est alors scellé à l'aide de la colle UV curable, laissant une petite ouverture de sortie d'air.
Stock 4 Stock 3 Stock 2 Stock 1 H 3 BO 3
2.86g/literK 2 HPO 4: 3H 2 O
4.0g/literMgSO 4: 7H 2 O
7.5g/literNa 2 Mg EDTA 0.1g/liter MnCl 2: 4H 2 O
1.81g/literFerrique 0.6g/liter citrate d'ammonium ZnSO 4: 7H 2 O
0.222g/literL'acide citrique: 1H2O
0.6g/literCuSO 4: 5H 2 O
0.079g/literCaCl 2: 2H 2 O
3.6g/literCOCl 2 : 6H 2 O
0.050g/literNamoo 4: 2H 2 O
0.391g/liter
Schéma 1. Préparation du BG-11 moyennes.
3. ESR expériences de micro-imagerie
- Pour commencer l'expérience d'imagerie, tournez sur la RSE de micro-imagerie système et insérez l'échantillon dans le résonateur qui va à l'intérieur de la sonde d'imagerie.
- Maintenant, en utilisant le logiciel de contrôle d'ordinateur, réglez le système sur le mode "Tune" et de trouver la fréquence micro-ondes de résonance de la sonde, qui sera utilisé pour les mesures de l'ESR.
- Suite à cela, définissez le champ magnétique statique sur la valeur qui correspond à la fréquence micro-ondes appliquée, réglez les paramètres de timing pour la séquence d'impulsions et d'observer le signal ESR pour s'assurer que le système fonctionne bien et l'échantillon est bien préparé.
- Ensuite, définissez les paramètres d'imagerie, telles que le nombre de pixels, la force des gradients, et la longueur des impulsions de gradient à leurs valeurs requises.
- Après l'installation, recueillir trois images 3D ESR par une séquence d'écho de Hahn imagerie impulsion (figure 4) avec une séparation interpulse, les valeurs de 500, 600 et 700 ns.
- Lumière projetée à l'échantillon est allumé ou éteint selon les conditions requises expérimental.
- Pendant l'acquisition, les données sont automatiquement sauvegardées. Les thèses fichiers de données brutes sont ensuite traitées via le script du logiciel Matlab pour fournir des images de la concentration trityle radical et le temps de relaxation T 2 carte, qui est traduit en une image la concentration en oxygène via une pré-existants d'étalonnage.
4. Les résultats représentatifs
Les résultats de l'expérience sont en trois dimensions de plusieurs ESR micro-images enregistrées à des valeurs τ différents. Typiques premières images données sont fournies dans la Figure 5. Les trois meilleurs images, mesurée dans des conditions sombres, sont très similaires, sauf pour la réduction de l'intensité du signal. D'autre part, les changements de modèle d'image sous irradiation lumineuse due à des temps de relaxation différents dans différentes parties de l'échantillon. Ces données peuvent être traitées une à obtenir une image d'amplitude, comme le montre la figure 6 et également des images du temps de relaxation T 2 (figure 7). Les deux images T sont convertis en valeurs de concentration d'oxygène à travers une courbe de calibration pré-existante qui relie la concentration en oxygène au temps de relaxation grâce à l'équation: 
Ici, T 2 0 est le temps de relaxation spin-spin de la sonde dans des conditions anoxiques (en fonction de la concentration de la sonde, C, et son coefficient de diffusion, D), et k est une constante de proportionnalité. Dans la plupart des cas, le coefficient de diffusion ne varie pas beaucoup d'échantillons vivants (quoique, si nécessaire, il peut en principe être directement évalués également par ESR 6, 10), et la concentration de rotation est obtenu au cours du processus d'imagerie. Par conséquent, cette relation peut être utilisée pour mesurer directement la concentration en oxygène.
Pour en revenir à la figure 6, il est évident d'après l'image d'amplitude que les cellules de cyanobactéries ont été principalement situés sur le côté droit du porte-échantillon. En outre, sur la figure 7, il est clair que la lumière déclenche la production d'O 2 et provoque une augmentation significative de la solution S 2 de concentration, principalement dans les voxels à proximité de la cyanobactérie.
Figure 1: Les niveaux d'énergie dans la résonance spin de l'électron.
Figure 2: l'image typique de la concentration en oxygène d'une souris portant une tumeur. L'image de gauche montre les informations anatomiques, basé sur une image IRM. Un libre stable radical organique a été injecté à la souris et ses caractéristiques ESR fournir la concentration d'oxygène à son environnement (à droite). ESR-base des résultats sont superposées sur l'image IRM anatomique. Champ de vision est de 32 mm.
Figure 3: Deux exemples de haute résolution de micro-échelle ESImages R de l'échantillon photolithographie générés avec N @ C 60 en poudre (à gauche) et des cristaux paramagnétiques LIPC (à droite)
Figure 4: typique Hahn imagerie séquence d'impulsions micro-ondes montrant l'(MW) et le gradient, G x, G y et z G impulsions.
Figure 5: typique données brutes ESR micro-images: a, b et c sont des données brutes de l'échantillon cyanobactérie sans éclairage en lumière mesurée pour τ = 500600700 ns, respectivement. Articles D, E, et sont les mêmes que a, b et c, mais avec un éclairage en lumière. L'intensité est tracée en échelle arbitraire (mais est compatible au sein de chaque ensemble de trois images sombres ou lumineuses données brutes)
Figure 6: image d'amplitude correspondant à la concentration dans la solution radicale (échelle arbitraire).
Figure 7: T 2 images et les correspondants [O 2] valeurs sous sombres (à gauche) et léger (à droite) les conditions.
Discussion
Ce protocole montre comment ESR de micro-imagerie peut être appliquée à cartographier la concentration d'oxygène à proximité de vivre de petits échantillons. Une résolution spatiale de ~ 30 x 30 x 100 um est démontré, avec une sensibilité quasi-micromolaires concentration en oxygène et sous-femtomoles sensibilité à l'oxygène absolue par voxel. L'utilisation de l'ESR de micro-imagerie pour la cartographie de l'oxygène à proximité de cellules complète les techniques actuellement disponibles à base de micro-électrodes ou de fluorescence / phosphorescence. Par ailleurs, avec la sonde paramagnétique appropriée, il sera facilement applicable pour l'oxygène intracellulaire de micro-imagerie, une capacité qui trouvent d'autres méthodes très difficile à réaliser. Dans le futur proche, nous prévoyons sur l'amélioration de cette méthodologie pour fournir des images en direct de l'échantillon avec une résolution de quelques microns, fournissant des paramètres de contraste telles que la concentration d'oxyde de super, l'acidité (pH), coefficient de diffusion de la sonde et, bien sûr, la concentration en oxygène. Ces capacités sont complémentaires à l'actuelle optique basée sur des méthodologies à la fois en termes de type de contraste et aussi des caractéristiques des échantillons (par exemple, non transparente des échantillons d'épaisseur et, dans certains cas, les mesures intracellulaire vs extracellulaire).
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été partiellement financé par des subventions non. 213/09 de la science israélienne Fondation, accorder aucune. 2005258 de la fondation du BSF, accorder aucune. 201665 du Conseil européen de la recherche (CER), et par l'Institut Russell Berrie Nanotechnology au Technion. Nous reconnaissons l'aide du professeur Noam Adir et Faris Salame de la Faculté de chimie Schulich du Technion concernant la fourniture et la manutention des cyanobactéries. L'aide et le soutien de Svetlana Yoffis du Technion Micro-Nano unité de fabrication est grandement appréciée.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Kendro | Heraus, 75003235 | |
| Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical | Novosibirsk | Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6. | |
| BG-11 buffer | For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9. | ||
| Syringe | Hamilton Co | Microliter 7000.5 | |
| Ultraviolet Curing | Norland Products, Inc. | NOA63, or NOA61. |
References
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