Summary
このプロトコルは、電子スピン共鳴顕微鏡による生細胞の周囲の環境中の酸素濃度のミクロンスケールの三次元イメージングのための方法を説明します。
Abstract
このプロトコルは、ミクロンスケールの分解能1で生きている細胞の直接の環境中の酸素濃度の三次元マッピングのための電子スピン共鳴（ESR）マイクロイメージングの方法を説明します。酸素は生命のサイクルの中で最も重要な分子の一つである。それはミトコンドリアで酸化的リン酸化の端末の電子受容体として機能し、活性酸素種の生産に使用されています。酸素の測定は、ミトコンドリアや代謝機能、シグナル伝達経路、様々な刺激、膜透過性、および疾患の分化の効果の研究に重要である。酸素消費量は、全体の生物への細胞へのミトコンドリアからの様々な生物学的システムに広く適用可能である、したがって、細胞代謝の有益なマーカーです。その重要性から、多くのメソッドは、ライブシステムでの酸素の測定のために開発されている。高解像度の酸素のイメージングを提供するために、現在の試みは、主に彼らは高い光毒性および低酸素感度を持つプローブを採用するとして、満足のいく結果を提供することができない光学的蛍光と燐光の方法に基づいています。サンプル中の外因性の常磁性プローブからの信号を測定するESRは、酸素濃度の非常に正確な測定を提供することが知られている。典型的なケースでは、ESR測定は、プローブの線形拡大および/または局所酸素濃度に直接リンクされている緩和時間の短縮をマップします。 （酸素は常磁性であるため、外因性の常磁性プローブに衝突するときに、その緩和時間を息切れ。）伝統的に、実験のこれらのタイプは、低解像度、小動物イメージングのためのミリメートルスケールのESRで行われている。ここでは、ESRイメージングも小さなライブサンプルの検査のためにミクロンスケールで実施することができる方法を示します。 ESRマイクロイメージングは、室温2で1ミクロンに近づき解像度と空間分解ESR信号の取得を可能にする比較的新しい手法です。このプロトコルは、紙の主な目的は、この新しいメソッドは、新しく開発された酸素に敏感なプローブと一緒に、小さなライブ試料中の酸素濃度のマッピングに適用できる方法を示すことです。 〜30の空間分解能は、× 30 × 100μmの近マイクロモルの酸素濃度の感度とボクセル毎のサブフェムトモル絶対酸素感度で、実証されている。細胞の近くに酸素のマッピングのためのESRマイクロイメージングの使用は、微小電極や燐光/蛍光に基づいて、現在利用可能な技術を補完します。さらに、適切な常磁性プローブと、それはまた、細胞内の酸素マイクロイメージング、他の方法を達成するのは非常に困難な能力のために容易に適用されます。
Protocol
1。 ESRマイクロイメージングの概要
最初に、我々は、ESRの簡単な説明、ESR顕微鏡、そして私たちのシステムのさまざまなコンポーネントを提供し、我々は、実際のイメージング実験を説明します。
電子スピン共鳴は、特定の周波数での電磁放射が外部静磁場（図1）下に置かれ、不対電子のスピンを持つ分子によって吸収される分光技術です。 ESRは、フリーラジカルや常磁性中心の検出と識別のために、このような化学、生物学、物理学、材料科学などの科学の幅広い分野で採用されている。それはライブの種で常磁性分子の環境を研究するための強力な方法であり、酸性度（pH値）、粘度、酸素、および活性酸素種の濃度が3に関する情報を提供します。
異種のサンプルについて、ESRスペクトル情報は、磁場勾配4の使用によって、（すなわち、画像を取得することによって）空間分解方法で得ることができます。これは主にプロトンのスピンを観測する磁気共鳴イメージングのより一般的な方法（MRI）と非常によく似ています。これまで、このようなESRイメージング技術は、数センチの比較的大きなサイズで、mmはスケールの分解能で生きたままの標本に適用した。 ESRイメージングにおける（例えば、参考文献5から取り出した図2を参照。）比較的最近の開発は、ミリ波、サブミリサイズの試料の測定値にミリメートルスケールの分解能で小動物を見てからその機能を拡張したものですミクロンスケールの分解能。このフィールドは、1ミクロン2（図3に代表的な例を参照）に近づい分解能で3次元ESR画像を提供することができる今日ESR顕微鏡、として知られています。
ESR顕微鏡は、従来のESR分光器と本質的に似ています。これは、取得プロセスおよびデータ処理を制御するための静的フィールド、スピン励起と信号検出のためのマイクロ波システム、サンプルを保持するためのプローブ、およびコンピュータ化されたコンソールを生成するための磁石を持っています。一般的にESRイメージングユニークとESR縮小コピーを作るにも、既存の他のコンポーネントには、イメージングプローブに配置されている磁気電子システムの一部であるフィールドの勾配の源、および勾配コイルです。私たちの特定のシステムの詳細については、プロトコルの映画の中で示され、参考文献2に記載されています。
2。 ESRマイクロイメージングサンプルの調製
この段階では、ESRマイクロイメージングの実験用サンプルの調製方法を説明します。この段階の細胞の最後にトリチルラジカル6の緩衝液と一緒に特別に準備ガラスのESR顕微鏡の試料容器の底部に配置されます。このプロトコルは、シアノバクテリア細胞の測定を説明し、従って、細胞の他のタイプのため、適切な調整は、サンプルの準備段階で必要になることがあります。
- 最初に、〜400 400μmの大きさと吸収紙のいくつかの正方形を取り、続いてシアノバクテリア懸濁液1.2 mlを（40 mg / mLの濃度で）で満たされているエッペンドルフチューブに挿入されます。
- 懸濁液を微量遠心機で6000rpmで2分間遠心分離する。
- この後、上清バッファが完全に藍藻脱水を避けるために残っている〜50μLを除いて削除されます。このプロセスの結果として、吸収紙は現在シアノバクテリアの細胞が飽和している。
- 細かいピンセットを使って、いくつかの繊維が紙から抽出され、カップ状、特別に準備ガラスの試料ホルダー7の底部に配置されます。 BG - 11溶液8、9のトリチル3mMのは（スキーム1参照）細かいシリンジの援助により、試料ホルダーに追加されていることを以下。ホルダーは、小さな排気口が開いたまま、UV硬化型接着剤を用いて封止されている。
株式4 株式3 在庫2 在庫1 H 3 BO 3
2.86g/literK 2 HPO 4：3H 2 O
4.0g/literMgSO 4を ： 7H 2 O
7.5g/literのNa 2 MgのEDTA 0.1g/liter MnCl 2を ：4H 2 O
1.81g/literクエン酸第二鉄アンモニウムの0.6g/liter ZnSO 4 · 7H 2 O
0.222g/literクエン酸：1H2O
0.6g/liter4 ·：5H 2 O
0.079g/liter塩化カルシウム：2H 2 O
3.6g/literのCoCl 2 ：6H 2 O
0.050g/literNaMoO 4：2H 2 O
0.391g/liter
スキーム1。BG - 11培地の調製。
3。 ESRマイクロイメージング実験
- イメージング実験を開始するには、ESRマイクロイメージングシステムをオンにし、イメージングプローブの内部に入ることを共振器に試料を挿入する。
- 今、コンピュータの制御ソフトウェアを使用して、"チューニング"モードでシステムを設定し、ESR測定に使用されるプローブの共振マイクロ波の周波数を見つける。
- ていることに続いて、適用されるマイクロ波の周波数と一致する値に静磁場を設定し、パルスシーケンスのタイミングパラメータを設定してもシステムが機能するとサンプルが十分用意されていることを確認するためにESR信号を観測。
- その後、このような画素数としてイメージングパラメータ、、勾配の強さ、そしてそれらの必要な値に勾配パルスの長さを設定します。
- セットアップに続いて、パルス間の分離、500、600の値、および700ナノ秒とハーンエコーイメージングのパルスシーケンス（図4）によって三次元ESR画像を収集する。
- サンプルで投射された光は、必要な実験条件に応じてオンまたはオフになっています。
- 買収時には、データが自動的に保存されます。論文生データファイルは、トリチルラジカル濃度と緩和時間の画像をT 2、既存のキャリブレーションを介して酸素濃度の画像に変換されるマップを、提供するために、MATLABソフトウェアのスクリプトを介して処理されます。
4。代表的な結果
実験の結果は、異なるτの値で記録された複数の三次元ESRマイクロ画像です。典型的な生データの画像を図5に提供されています。暗条件下で測定した上位3つの画像は、信号強度の減少を除いて非常によく似ています。一方、試料の異なる部分で異なる緩和時間による光照射下での画像パターンの変化。このデータは、図6に示すように、また、緩和時間、T 2（図7）の画像、振幅の画像を取得するには、1を処理することができます。 T 2の画像は、方程式を経由して緩和時間に酸素濃度を結ぶ既存の検量線を経由して酸素濃度の値に変換されます。 
ここで、T 2 0は、無酸素条件下でのプローブのスピン-スピン緩和時間（プローブの濃度、C、に応じて、その拡散係数、D）であり、kは比例定数である。ほとんどの場合、拡散係数は、（必要であれば、それは原則的に直接ESR 6,10によっても評価できる、が）ライブサンプルのためにあまり変化しない、とスピン濃度は、イメージングプロセス中に取得されたものです。したがって、この関係は直接に酸素濃度を測定することができます。
図6に戻ると、それは、シアノバクテリアの細胞は主に、サンプルホルダの右側に位置していることが振幅画像から明らかである。さらに、図7に基づいて、それは光がO 2の生産を開始し、主にシアノバクテリアに近いボクセルで、ソリューションのO 2濃度の有意な増加を引き起こすことは明らかである。
図1：電子スピン共鳴のエネルギー準位。
図2：担癌マウスの代表的な酸素濃度のイメージ。左の画像は、MRI画像に基づいて、解剖学的情報を示しています。安定した遊離有機ラジカルは、マウスに注入し、そのESR特性は、その環境での酸素濃度を（右）を提供した。 ESRベースの結果は、MRI解剖学的画像上に重畳されています。ビューのフィールドは32 mmです。
図3：高分解能マイクロスケールのESの二つの例N @ C 60粉末（左）とLiPc常磁性結晶とフォトリソグラフィにより生成されたサンプルのRの画像（右）
図4：典型的なマイクロ波を示すハーンイメージングパルスシーケンス（MW）と勾配、G X、G y及びG zのパルス。
図5：典型的な生データESRマイクロ画像：a、b、およびcはそれぞれ、τ= 500600700ナノ秒で測定された無光照射によるシアノバクテリアサンプルの生データです。項目D、E、及び、b、およびcと同じですが、光照射と同じです。強度は、（が、3つの暗いまたは明るい生データの画像の各セット内で一貫している）任意のスケールでプロットされています
図6：溶液中のラジカル濃度（任意スケール）に対応する振幅画像。
図7：T 2の画像と対応する値が暗い（左）とライト（右）の条件の下で[O 2]。
Discussion
このプロトコルは、ESRマイクロイメージングは、ライブの小さな試料の近くに酸素濃度をマップに適用できる方法を示しています。 〜30の空間分解能は、× 30 × 100μmの近マイクロモルの酸素濃度の感度とボクセル毎のサブフェムトモル絶対酸素感度で、実証されている。細胞の近くに酸素のマッピングのためのESRマイクロイメージングの使用は、微小電極や燐光/蛍光に基づいて、現在利用可能な技術を補完します。さらに、適切な常磁性プローブと、それは細胞内の酸素マイクロイメージング、他の方法を達成するのは非常に困難な能力のために容易に適用されます。近い将来、我々はもちろんのスーパーオキシドの濃度、酸性度（pH値）、プローブの拡散係数と、酸素濃度などのコントラストのパラメータを提供、さらに数ミクロンの分解能でのライブのサンプル画像を提供するために、この方法論を改善する予定。これらの機能は、両方ともコントラストタイプのとまたサンプルの特性（例えば、非透過的な厚さのサンプルと、いくつかのケースでは、細胞対細胞の測定）の点で現在の光ベースの手法と相補的である。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作業は、部分的にgrantないによってサポートされていました。イスラエル科学財団から213/09には、何を許可しない。 BSF基礎から2005258、助成金がない。欧州研究評議会（ERC）から201665、およびテクニオンでラッセルベリーナノテクノロジー研究所による。我々は、シアノバクテリアの供給及び取り扱いに関するテクニオンの化学のシューリックの学部から教授ノームADIRとファリスサラミの助けを認める。テクニオンマイクロナノファブリケーションユニットからのヘルプとスヴェトラーナYoffisのサポートが大幅に高く評価されています。Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Kendro | Heraus, 75003235 | |
| Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical | Novosibirsk | Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6. | |
| BG-11 buffer | For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9. | ||
| Syringe | Hamilton Co | Microliter 7000.5 | |
| Ultraviolet Curing | Norland Products, Inc. | NOA63, or NOA61. |
References
- Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance. Biophysical Journal. , Forthcoming (2010).
- Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications. J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).
- Gallez, B., Swartz, H. M. In vivo EPR: when, how and why? NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).
- Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. EPR imaging and in vivo EPR. , CRC Press. Boca Raton. (1991).
- Matsumoto, S. Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).
- Talmon, Y. Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE. ESR. J Phys Chem. , Forthcoming (2010).
- Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy. Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).
- Allen, M. M., Stanier, R. Y. Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae. J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria. J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).
- Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance. Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).
