Summary
Detta protokoll beskriver en metod för mikrometerstorlek tredimensionell avbildning av syrekoncentrationen i den närmaste omgivningen av levande celler genom att elektronens spin resonans mikroskopering.
Abstract
Detta protokoll beskriver en elektron spin resonans (ESR) mikro-imaging metod för tredimensionell kartläggning av syrehalten i den närmaste omgivningen av levande celler med micron skala upplösning 1. Syre är en av de viktigaste molekylerna i cykeln av liv. Den fungerar som terminal elektronacceptor av oxidativ fosforylering i mitokondrierna och används i produktionen av reaktiva syreradikaler. Mätningar av syrgas är viktiga för att studera mitokondriella och metabola funktioner, signalvägar, effekter av olika stimuli, permeabilitet och sjukdom differentiering. Syreförbrukning är därför en informativ markör av cellulär metabolism, vilken i stort gäller för olika biologiska system från mitokondrier till celler till hela organismer. På grund av dess betydelse, har många metoder utvecklats för mätning av syre i levande system. Aktuella försök att ge hög upplösning syre avbildning är huvudsakligen baserade på optiska fluorescens och fosforescens metoder som inte ger tillfredsställande resultat när de anställer sonder med hög foto-toxicitet och låg syre känslighet. ESR, som mäter signalen från exogena paramagnetiska sonder i urvalet, är känd för att ge mycket exakta mätningar av syrehalten. I ett typiskt fall ESR mätningar karta sondens lineshape breddning och / eller avslappning i tid förkorta som är kopplade direkt till den lokala syrehalten. (Syre är paramagnetiska, och därför vid kollision med den exogena paramagnetiska sonden, den korta sina avkoppling gånger.) Tidigare har dessa typer av experiment som utförs med låg upplösning, millimeter skala ESR för smådjur avbildning. Här visar vi hur ESR bildbehandling också kan utföras i micron skala för undersökning av små lever prover. ESR mikro-avbildning är en relativt ny metod som möjliggör förvärv av rumsligt-löst ESR signaler med en upplösning som närmar sig 1 mikron i rumstemperatur 2. Det huvudsakliga syftet med detta protokoll-papper är att visa hur denna nya metod, tillsammans med nyutvecklade syrekänsliga sonder, kan tillämpas på kartläggning av syrehalten i små lever prover. En rumslig upplösning på ~ 30 x 30 x 100 ìm visas, med nästan mikromolära syrehalt känslighet och sub-femtomole absolut syre känslighet per Voxel. Användningen av ESR mikro-avbildning för syre kartläggning nära cellerna kompletterar nu tillgängliga tekniker som bygger på mikro-elektroder eller fluorescens / fosforescens. Dessutom med rätt paramagnetiska sonden blir det också lätt tillämpliga för intracellulär syre mikro-avbildning, en förmåga som andra metoder få mycket svårt att uppnå.
Protocol
1. Översikt över ESR Micro-imaging
Först ger vi en kort förklaring av SR, SR mikroskopi, och de olika delarna av vårt system, och då kommer vi att beskriva de faktiska imaging experiment.
Elektronens spin resonans är en spektroskopiska teknik där elektromagnetisk strålning vid en specifik frekvens absorberas av molekyler med oparade elektron snurrar, som hänförts till ett externt statiskt magnetfält (Figur 1). ESR är anställd i breda vetenskapsområden, såsom kemi, biologi, fysik och materialvetenskap, för upptäckt och identifiering av fria radikaler och centra paramagnetiska. Det är en kraftfull metod för att studera miljön i paramagnetiska molekyler i levande arter och ger information om surhetsgrad (pH), viskositet, syre och reaktiva ämnen syrehalterna 3.
För heterogena prover, kan ESR spektral information erhålls i ett rumsligt upplösta sätt (dvs genom att skaffa en bild), med hjälp av magnetfält gradienter 4. Detta är mycket lik den vanligare metoden för magnetisk resonanstomografi (MRT) som huvudsakligen konstaterar proton snurrar. Hittills har sådana ESR avbildningstekniker ansökt om levande exemplar med relativt stora storleken på ett par centimeter och i mm-skala upplösning. (Till exempel se figur 2, hämtad från referens 5.) En relativt ny utveckling i ESR bildbehandling är utvidgningen av dess möjligheter från att titta på små djur på millimeter-skala resolution till mätningar av millimeter-och sub-millimeter-storlek prover med micron skala upplösning. Detta fält kallas ESR mikroskopi, som idag kan ge 3D ESR bilder med en upplösning som närmar sig 1 mikron 2 (se representativa exempel i figur 3).
En ESR mikroskop i allt väsentligt liknar en konventionell ESR spektrometer. Den har en magnet för att generera det statiska fält, en mikrovågsugn för spin excitation och signal upptäckt, en sond för att hålla provet, och en datoriserad konsol för att styra förvärvsprocessen och datahantering. Övriga komponenter som är unika ESR bildbehandling i allmänhet och existerande även i ESR microcopy är magnetfältsgradienten källor, som ingår i det elektroniska systemet, och spolar gradient som finns i bildbehandling sonden. Mer information om våra specifika system framgår av protokollet filmen och som beskrivs i referens 2.
2. ESR Micro-imaging Provberedning
Detta steg beskriver metoden för provberedning för ESR mikro-imaging experiment. I slutet av denna fas celler placeras på botten av en speciellt förberedd glas ESR mikroskopi provbehållare tillsammans med en trityl radikal 6 buffertlösning. Detta protokoll beskriver mätning av cyanobakterier celler och därmed för andra typer av celler, får ordentlig justering behövas vid provberedning scenen.
- Först är några rutor av absorberande papper med en storlek på ~ 400 400 ìm tas och infogas i ett Eppendorf-rör som sedan fylls med 1,2 ml av cyanobakterier suspension (vid en koncentration av 40 mg / ml).
- Suspensionen centrifugeras i 2 minuter vid 6000 rpm i mikrocentrifug.
- Efter detta är supernatanten bufferten helt bort utom för ~ 50 mikroliter som är kvar för att undvika cyanobakterier uttorkning. Som ett resultat av denna process är det absorberande papper nu mättad av cyanobakterier celler.
- Med fin pincett, är några fibrer ur papper och placeras på botten av en kopp-liknande speciellt beredd glas provhållaren 7. Efter att en 3 mm trityl i BG-11-lösning 8, 9 (se schema 1) läggs till i provhållaren med hjälp av en fin spruta. Hållaren är då tätas med UV-härdande lim, vilket ger en liten luftutsläppet öppen.
Lager 4 Lager 3 Lager 2 Lager 1 H 3 BO 3
2.86g/literK 2 HPO 4: 3H 2 O
4.0g/literMgSO 4: 7H 2 O
7.5g/literNa 2 mg EDTA 0.1g/liter MnCl 2: 4H 2 O
1.81g/literJärnammoniumcitrat 0.6g/liter ZnSO 4: 7H 2 O
0.222g/literCitronsyra: 1H2O
0.6g/literCuSO 4: 5H 2 O
0.079g/literCaCl 2: 2H 2 O
3.6g/literCOCl 2 : 6H 2 O
0.050g/literNaMoO 4: 2H 2 O
0.391g/liter
System 1. Beredning av BG-11 medium.
3. ESR Micro-imaging experiment
- För att börja imaging experiment, slå på ESR mikro-bildsystem och för in provet i resonator som går inne i bildbehandling sonden.
- Nu, med hjälp av programvaran datorkontroll, ställa in systemet på "Tune" läge och hitta frekvensresonansteknik mikrovågsugn av sonden, som kommer att användas för ESR mätningar.
- Efter att ställa in den statiska magnetfält på det värde som motsvarar den tillämpade mikrovågsugn frekvens, ställa in tiden parametrar för pulssekvens och observera ESR-signalen för att säkerställa att systemet fungerar väl och urvalet är väl förberedda.
- Sedan ställer du in avbildning parametrar, såsom antalet pixlar, styrkan i övertoningar och längden på övertoningen pulser till önskade värden.
- Efter installation, samla in tre 3D ESR bilder genom en Hahn eko imaging pulssekvens (Figur 4) med interpulse separation, värden 500, 600 och 700 ns.
- Ljus projiceras på provet slås på eller av beroende på vilken experimentella förhållanden.
- Under förvärvet data automatiskt sparas. Avhandlingar rådata filer bearbetas sedan via Matlab programvara script för att ge bilder av trityl radikala koncentration och avslappning tiden T 2 karta, som är översatt till en syrehalt bild via befintlig kalibrering.
4. Representativa resultat
Resultaten av experimentet är flera tredimensionella ESR mikro-bilder som är tagna vid olika τ-värden. Typiska rådata bilder finns i Figur 5. De tre bästa bilderna, uppmätta under mörka förhållanden, är mycket lika förutom minskad signalstyrka. Å andra sidan, bilden förändras, i ljuset bestrålning på grund av de olika avkoppling tidpunkter i olika delar av provet. Denna data kan bearbetas 1 för att få en amplitud bild, som visas i Figur 6 och även bilder av avkoppling tid, T 2 (Figur 7). T 2 bilder omräknas till värden syrekoncentration via en befintlig kalibreringskurva som länkar syrehalten till avkoppling tid via ekvation: 
Här är T 2 0 spinn-spinn av sonden under anoxiska förhållanden (beroende på sondens koncentration, C, och dess spridning koefficient, D), och k är en proportionalitet konstant. I de flesta fall inte variera diffusionskoefficient inte mycket för live-prov (även om det behövs, kan den i princip direkt att utvärderas också genom ESR 6, 10), och spin koncentration erhålls under imaging process. Därför kan detta förhållande användas för att direkt mäta syrehalten.
Går tillbaka till figur 6 är det tydligt av amplituden bilden att cyanobakterier cellerna fanns främst på höger sida av provhållaren. Vidare bygger på figur 7 är det tydligt att ljuset initierar produktionen av O 2 och orsakar en betydande ökning i lösningen O 2-koncentration, främst i voxlar nära cyanobakterier.
Figur 1: Energi nivåer i elektronens spin resonans.
Figur 2: Typisk syrekoncentration bilden av en tumör med mus. Bilden till vänster visar anatomisk information, baserad på en MR-bild. En stabil fri organisk radikal injicerades med musen och dess ESR egenskaper ger syrehalten i sin omgivning (höger). ESR-baserade resultat är över på MR-anatomiska bilden. Synfält är 32 mm.
Figur 3: Två exempel på hög upplösning mikro-skala ESR bilder av photolithographically-genererade prov med N @ C 60 pulver (vänster) och LiPc kristaller paramagnetiska (höger)
Figur 4: Typisk Hahn imaging pulssekvens visar mikrovågsugn (MW) och lutning, G x, y G och G z pulser.
Figur 5: Typisk rå-data ESR mikro-bilder: A, B, och C är rådata av cyanobakterien provet med något ljus uppmätta belysningen för τ = 500.600.700 ns, respektive. Objekt D, E, och är samma som A, B och C, men med ljus belysning. Intensitet ritas i godtycklig skala (men är konsekvent inom varje uppsättning av tre mörk eller ljus rådata bilder)
Figur 6: Amplitud bild motsvarande den radikala koncentrationen i lösningen (godtycklig skala).
Figur 7: T 2 bilder och motsvarande [O 2] värden under mörker (vänster) och ljus (höger) förhållanden.
Discussion
Detta protokoll visar hur ESR mikro-avbildning kan användas för att kartlägga syrekoncentration nära Live små prover. En rumslig upplösning på ~ 30 x 30 x 100 ìm visas, med nästan mikromolära syrehalt känslighet och sub-femtomole absolut syre känslighet per Voxel. Användningen av ESR mikro-avbildning för syre kartläggning nära cellerna kompletterar nu tillgängliga tekniker som bygger på mikro-elektroder eller fluorescens / fosforescens. Dessutom med rätt paramagnetiska sonden kommer det att vara lätt tillämpliga för intracellulär syre mikro-avbildning, en förmåga som andra metoder få mycket svårt att uppnå. Inom den närmaste framtiden planerar vi för att ytterligare förbättra denna metod för att ge live-prov bilder med en upplösning på några mikrometer, som ger kontrast parametrar som super oxid koncentration, surhetsgrad (pH), sond diffusionskoefficient och, naturligtvis, syrehalt. Dessa funktioner är ett komplement till den nuvarande optiska-baserade metoder både vad gäller kontrast typ och även av prover egenskaper (t.ex. icke-transparenta tjocka prover och i vissa fall, intracellulära vs extracellulära mätningar).
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har delvis stöd av bidrag nr. 213/09 från den israeliska Science Foundation, bidrag nr. 2005258 från BSF stiftelsen bevilja nej. 201.665 från Europeiska forskningsrådet (ERC), och av Russell Berrie Nanotechnology Institute vid Technion. Vi erkänner hjälp av professor Noam Adir och Faris Salame från Schulich fakulteten för kemi vid Technion om leverans och hantering av cyanobakterier. Den hjälp och stöd av Svetlana Yoffis från Technion mikro-nano Fabrication Unit är mycket uppskattat.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Kendro | Heraus, 75003235 | |
| Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical | Novosibirsk | Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6. | |
| BG-11 buffer | For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9. | ||
| Syringe | Hamilton Co | Microliter 7000.5 | |
| Ultraviolet Curing | Norland Products, Inc. | NOA63, or NOA61. |
References
- Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance. Biophysical Journal. , Forthcoming (2010).
- Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications. J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).
- Gallez, B., Swartz, H. M. In vivo EPR: when, how and why? NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).
- Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. EPR imaging and in vivo EPR. , CRC Press. Boca Raton. (1991).
- Matsumoto, S. Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).
- Talmon, Y. Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE. ESR. J Phys Chem. , Forthcoming (2010).
- Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy. Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).
- Allen, M. M., Stanier, R. Y. Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae. J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria. J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).
- Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance. Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).
