Summary
Bu protokol, elektron spin rezonans mikroskobu ile canlı hücreler hemen ortamda oksijen konsantrasyonu mikron ölçekli üç boyutlu görüntüleme için bir yöntem açıklanır.
Abstract
Bu protokol mikron ölçekli çözünürlük 1 canlı hücreleri derhal ortamda oksijen düzeyleri üç boyutlu haritalama için bir elektron spin rezonans (ESR) mikro görüntüleme yöntemi açıklamaktadır. Oksijen yaşam döngüsünde en önemli moleküllerden biridir. Mitokondride oksidatif fosforilasyon terminal elektron alıcısı olarak görür ve reaktif oksijen türlerinin üretiminde kullanılır. Oksijen ölçümleri, mitokondriyal ve metabolik fonksiyonları, sinyal yolları, çeşitli uyaranların, membran geçirgenlik ve hastalık farklılaşma etkisi çalışması için önemlidir. Oksijen tüketimi, bu nedenle, bütün organizmaların hücreleri mitokondri çeşitli biyolojik sistemler geniş uygulanabilir hücre metabolizması, bilgilendirici bir göstergedir. Önemi nedeniyle, pek çok yöntem canlı sistemlerde oksijen ölçümleri için geliştirilmiştir. Şu girişimleri yüksek çözünürlüklü oksijen görüntüleme sağlamak için, özellikle yüksek foto-toksisite ve düşük oksijen hassasiyeti problar istihdam olarak tatmin edici sonuçlar sağlamak için başarısız optik floresans ve fosforesans yöntemleri dayanmaktadır. ESR, örnek dışsal paramanyetik probları sinyal ölçer, oksijen konsantrasyonu çok hassas ölçümler sağlamak için bilinir. Tipik bir vakada, ESR ölçümleri prob lineshape genişletilmesi ve / veya yerel oksijen konsantrasyonu doğrudan bağlantılı olan dinlenme süresini kısaltarak haritası. (Oksijen paramanyetik; bu nedenle, dışsal paramanyetik probu ile çarpışan, onun rahatlama kez darlığı.) Geleneksel olarak, bu tür deneyler, düşük çözünürlüklü, küçük hayvanlar görüntüleme için milimetre çaplı ESR ile yürütülmektedir. Burada da küçük canlı örneklerin incelenmesi için ESR görüntüleme mikron ölçeğinde yapılmalıdır nasıl göstermektedir. ESR mikro görüntüleme, oda sıcaklığında 2 1 mikron yaklaşan bir çözünürlük ile mekansal çözüme ESR sinyalleri toplanmasını sağlayan nispeten yeni bir metodoloji . Bu protokol kağıt ana amacı, bu yeni yöntem, yeni geliştirilen oksijen duyarlı problar ile birlikte, küçük canlı örneklerinde oksijen düzeyleri haritalama uygulanabilir nasıl göstermektir. Mekansal çözünürlükte ~ 30 x 30 x 100 mikron yakın mikromolar oksijen konsantrasyonu duyarlılık ve voksel başına alt femtomole mutlak oksijen hassasiyeti göstermiştir. ESR mikro görüntüleme kullanımı hücrelerin yakın oksijen haritalama için mikro elektrotlar veya fosforesans / floresan dayalı mevcut teknikleri tamamlar. Ayrıca, uygun paramanyetik probu ile, aynı zamanda hücre içi oksijen mikro-görüntüleme, diğer yöntemlerle elde etmek için çok zor bir yeteneği kolayca uygulanabilir olacaktır.
Protocol
1. ESR Micro görüntüleme Genel Bakış
Öncelikle, kısa bir açıklama ESR, ESR mikroskopi ve sisteminin çeşitli bileşenleri sağlamak ve o zaman gerçek görüntüleme deneyleri anlatacağız.
Elektron spin rezonans, altına yerleştirilen bir dış statik manyetik alan (Şekil 1), belirli bir frekansta elektromanyetik radyasyon eşleşmemiş elektron spin molekülleri tarafından emildiği bir spektroskopik tekniktir. ESR, serbest radikaller ve paramanyetik merkezleri ve kimlik tespiti için, kimya, biyoloji, fizik, malzeme bilimi gibi bilim geniş alanlarda istihdam edilmektedir. Bu canlı türlerinin paramanyetik moleküllerin çevre eğitimi için güçlü bir yöntemdir ve asitlik (pH), viskozite, oksijen, ve reaktif oksijen türleri konsantrasyonları 3 hakkında bilgi sağlar.
ESR, heterojen örnekleri için, spektral bilgileri, manyetik alan gradyanlar 4 kullanımı yoluyla, mekansal çözüme bir şekilde (yani, bir görüntü elde ederek) elde edilebilir. Bu esas olarak proton spin gözlemler manyetik rezonans görüntüleme (MRG) daha yaygın yöntem çok benzer. Şimdiye kadar, bu ESR görüntüleme teknikleri birkaç santimetre nispeten büyük boyutu ve çözünürlük mm çaplı canlı örnekler için uygulanmıştır. ESR görüntülemede (Örneğin Şekil 2, 5 referans alınan bakın.) Nispeten yeni bir gelişme milimetre ve alt milimetre boyutunda örneklerin ölçümleri milimetre çaplı çözünürlükte küçük hayvanlar bakarak yeteneklerini uzantısı mikron ölçekli çözünürlüğü. Bu alan, 1 mikron 2 (Şekil 3 temsilcisi örneklerini görmek) yaklaşan bir çözünürlüğe sahip 3D ESR görüntüleri sağlayabilir bugün ESR mikroskopi olarak bilinir .
ESR mikroskop aslında geleneksel bir ESR spektrometresi benzer. Bu satın alma süreci ve veri işleme kontrol etmek için statik alan, spin eksitasyon ve sinyal tespiti için bir mikrodalga sistemi, örnek tutmak için bir sonda ve bilgisayarlı bir konsol üretmek için bir mıknatıs vardır. Diğer bileşenler benzersiz ESR genel görüntüleme ve ESR küçük kopya da mevcut görüntüleme probu bulunmaktadır manyetik elektronik sistemin bir parçası alanında degrade kaynakları, ve degrade bobinleri. Bizim özel sistem hakkında daha fazla bilgi protokol filmde gösterilen ve referans 2'de açıklanmıştır.
2. ESR Micro görüntüleme Numune Hazırlama
Bu aşama, ESR mikro görüntüleme deney için numune hazırlama yöntemi açıklanmıştır. Bu aşamada hücreler sonunda trityl radikal 6 tampon çözelti ile birlikte, özel olarak hazırlanmış cam ESR mikroskopi numune kabı alt yerleştirilir . Bu protokol siyanobakteriler hücrelerinin ölçüm açıklar ve bu nedenle, diğer hücre türleri için uygun ayarlamalar numune hazırlama aşamasında gerekli olabilir.
- İlk olarak, ~ 400 400 mikron boyutunda emici kağıt birkaç kareler alınan ve daha sonra 1.2 mL (40 mg / ml 'lik bir konsantrasyon) siyanobakteriler süspansiyon ile dolu bir Eppendorf tüp içine yerleştirilir.
- Süspansiyon bir mikrosantrifüj 6000 RPM 2 dakika süreyle santrifüj edilir.
- Bunu takiben, supernatant tampon ~ 50 mcL siyanobakteriler dehidratasyonu önlemek için sol dışında tamamen kaldırılır. Bu sürecin bir sonucu olarak, emici kağıt siyanobakteriler hücreleri tarafından doymuş yağlardır.
- Ince cımbız kullanarak, birkaç lif kağıt ayıklanır ve bir bardak gibi özel olarak hazırlanmış cam numune tutucu 7 altına yerleştirilir. Trityl BG-11 çözüm 8, 9, 3 mM (bkz: Programı 1) ince bir şırınga yardımıyla numune tutucu eklenir . Sahibi, daha sonra küçük bir hava çıkışı açık bırakarak, UV yapıştırıcı kullanarak mühürlü.
Stok 4 Stok 3 Stok 2 Stok 1 H 3 BO 3
2.86g/literK 2 HPO 4: 3H 2 O
4.0g/literMgSO 4: 7H 2 O
7.5g/literNa 2 Mg EDTA 0.1g/liter MnCl 2: 4H 2 O
1.81g/literFerrik amonyum sitrat 0.6g/liter ZnSO 4: 7H 2 O
0.222g/literSitrik asit: 1H2O
0.6g/literCuSO 4: 5H 2 O
0.079g/literCaCl 2: 2H 2 O
3.6g/literCOCl 2 : 6H 2 O
0.050g/literNaMoO 4: 2H 2 O
0.391g/liter
Programı 1. BG-11 ortamın hazırlanması.
3. ESR Micro-görüntüleme Deneyler
- Görüntüleme deney başlamak için, ESR mikro görüntüleme sistemi açmak ve görüntüleme probu içine girdiğini rezonatör örnek eklemek.
- Şimdi, bilgisayar kontrol yazılımı kullanarak, "Dinle" modunda sistem ve ESR ölçümleri için kullanılan prob rezonans mikrodalga frekans bulmak.
- Ki, darbe dizisi için zamanlama parametrelerini ayarlamak, uygulanan mikrodalga frekans eşleşen değer statik manyetik alan ve emin olmak için ESR sinyali gözlemlemek ardından bu sistemi fonksiyonları ve örnek iyi hazırlanmış.
- Sonra, piksel sayısını görüntüleme parametreleri, gradyanlar gücünü ve gerekli değerleri degrade bakliyat uzunluğu ayarlayın.
- Kurulum sonrasında interpulse ayırma, değerleri 500, 600, 700 ns ile Hahn eko görüntüleme darbe dizisi (Şekil 4), üç 3D ESR görüntüleri toplamak.
- Örnek olarak tahmin Işık gerekli deneysel koşullara bağlı olarak açık ya da kapalı.
- Satın alma sırasında, veriler otomatik olarak kaydedilir. Tezler ham veri dosyaları sonra trityl radikal konsantrasyon ve gevşeme zamanı önceden varolan bir kalibrasyon ile bir oksijen konsantrasyonu görüntü çevrilmiştir T 2 harita görüntülerini sağlamak için Matlab yazılımı komut dosyası üzerinden işlenir.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Deney sonuçlarının farklı τ değerleri kaydedilmiş üç boyutlu birkaç ESR mikro-görüntüleri. Tipik ham veri görüntüleri Şekil 5'te verilmektedir. Karanlık koşullar altında ölçülen en büyük üç fotoğraf, sinyal yoğunluğunda azalma dışında çok benzer. Öte yandan, örnek farklı yerlerinde farklı dinlenme süreleri nedeniyle ışık ışınlama altında görüntü düzeni değişir. Bu veriler, Şekil 6'da gösterildiği gibi ve aynı zamanda gevşeme zamanı, T 2 (Şekil 7) görüntüleri bir genlik görüntü elde etmek için 1 işlenmiş olabilir. T 2 görüntüleri denklemi üzerinden rahatlama zaman oksijen konsantrasyonu bağlantılar önceden varolan bir kalibrasyon eğrisi ile oksijen konsantrasyonu değerleri çevrilir: 
Burada, T 2 0 prob spin-spin relaksasyon zamanı anoksik koşullar altında (prob konsantrasyon, C ve D difüzyon katsayısı bağlı olarak), ve k bir orantılılık sabittir. Çoğu durumda, difüzyon katsayısı (gerekirse, prensip olarak doğrudan ESR 6, 10 ile de değerlendirilebilir, fakat) canlı örnekler için çok değişmez, ve spin konsantrasyon görüntüleme işlemi sırasında elde edilir. Bu nedenle, bu ilişkiyi doğrudan oksijen konsantrasyonu ölçmek için kullanılabilir.
Şekil 6 geri dönecek olursak, siyanobakteriler hücreler esas numune tutucu sağ tarafta yer olduğunu genlik görüntü açıktır. Ayrıca, Şekil 7 dayalı, ışık O 2 üretimi başlatır ve özellikle siyanobakteriler yakın vokseller, çözümün O 2 konsantrasyonunda önemli bir artışa neden olduğu açıktır.
Şekil 1: elektron spin rezonans enerji seviyeleri.
Şekil 2: Tipik bir Tümör taşıyan fare oksijen konsantrasyonu görüntü. MRI görüntü dayalı anatomik bilgi, soldaki görüntü gösterir. Kararlı bir serbest radikal organik fare enjekte ve kendi ESR özellikleri, çevresi (sağda), oksijen konsantrasyonu sağlar. ESR tabanlı sonuçları MRG anatomik görüntü üzerine bindirilmiş. Görüş alanı 32 mm.
Şekil 3: yüksek çözünürlüklü mikro ölçekli ES iki örnekPhotolithographically N @ C 60 tozu (solda) ve LiPc paramanyetik kristalleri ile oluşturulan örnek R görüntüleri (sağda)
Şekil 4: mikrodalga (MW) gösteren ve degrade, G x, G y ve G z bakliyat Tipik Hahn görüntüleme darbe dizisi
Şekil 5: Tipik ham veri ESR mikro görüntüler: a, b ve c = 500.600.700 ns sırasıyla τ ölçülen ışık aydınlatma cyanobacterium örnek ham veriler. Öğeler, d, e, ve a, b ve c gibi ama ışık aydınlatması ile aynıdır. Yoğunluğu keyfi ölçeğinde çizilmiştir (ancak, üç karanlık veya hafif ham veri görüntüleri her içinde tutarlı)
Şekil 6: Genlik radikal çözüm konsantrasyonu (keyfi ölçekli) karşılık gelen görüntü.
Şekil 7: T 2 görüntüler ve ilgili [O 2] değerleri koyu (solda) ve ışık koşulları altında (sağda).
Discussion
Bu protokol, ESR mikro-görüntüleme canlı küçük örnekler yanında oksijen konsantrasyonu haritaya nasıl uygulanabileceğini gösteriyor. Mekansal çözünürlükte ~ 30 x 30 x 100 mikron yakın mikromolar oksijen konsantrasyonu duyarlılık ve voksel başına alt femtomole mutlak oksijen hassasiyeti göstermiştir. ESR mikro görüntüleme kullanımı hücrelerin yakın oksijen haritalama için mikro elektrotlar veya fosforesans / floresan dayalı mevcut teknikleri tamamlar. Ayrıca, uygun paramanyetik probu ile, hücre içi oksijen mikro-görüntüleme, diğer yöntemlerle elde etmek için çok zor bir yeteneği kolayca uygulanabilir olacaktır. Yakın bir gelecekte, süper oksit konsantrasyonu, asitlik (pH), prob difüzyon katsayısı ve tabii ki, oksijen konsantrasyonu gibi kontrast parametreleri sağlayarak, daha birkaç mikron çözünürlüğü ile canlı örnek görüntüler elde etmek için bu metodoloji geliştirmek planlıyoruz. Bu yetenekler, kontrast tip açısından ve hem de örnekleri özellikleri (bazı durumlarda örneğin şeffaf olmayan kalın örnekleri, hücre içi vs. Ekstrasellüler ölçümler) mevcut optik tabanlı yöntemlere tamamlayıcı niteliktedir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen hibe no tarafından desteklenmiştir. 213/09 İsrail Bilim Vakfı, hiçbir hibe. 2005258 BSF kuruluşundan itibaren, hiçbir hibe. Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) 201.665 ve Russell Berrie Nanoteknoloji Enstitüsü tarafından Technion. Biz Siyanobakterinin arz ve işlenmesiyle ilgili Technion Kimya Schulich Fakültesi Prof. Noam Adir ve Faris salame yardım kabul ediyorsunuz. Technion Mikro-Nano Fabrikasyon Ünitesi Svetlana Yoffis yardım ve desteği büyük ölçüde takdir edilmektedir.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Kendro | Heraus, 75003235 | |
| Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical | Novosibirsk | Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6. | |
| BG-11 buffer | For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9. | ||
| Syringe | Hamilton Co | Microliter 7000.5 | |
| Ultraviolet Curing | Norland Products, Inc. | NOA63, or NOA61. |
References
- Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance. Biophysical Journal. , Forthcoming (2010).
- Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications. J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).
- Gallez, B., Swartz, H. M. In vivo EPR: when, how and why? NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).
- Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. EPR imaging and in vivo EPR. , CRC Press. Boca Raton. (1991).
- Matsumoto, S. Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).
- Talmon, Y. Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE. ESR. J Phys Chem. , Forthcoming (2010).
- Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy. Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).
- Allen, M. M., Stanier, R. Y. Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae. J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria. J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).
- Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance. Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).
