Summary
A doença de Parkinson tem sido relacionada à exposição a pesticidas. Aqui nós mostramos um método para entregar pesticidas usando uma sonda gástrica, na concentração desejada e um método para analisar seu efeito em alfa-sinucleína acumulação no sistema nervoso entérico.
Abstract
Na doença de Parkinson (DP), a patologia associada segue um padrão característico, envolvendo, nomeadamente, o sistema nervoso entérico 1,2 (ENS), o bulbo olfativo (OB), o núcleo motor dorsal do vago (DMV) 3, o intermediolaterais núcleo da 4 medula espinhal e substância negra, fornecendo a base para a realização neuropatológicas da doença 4,5. A ENS e os OB são as estruturas mais expostas nervoso e os primeiros a ser afetados. Curiosamente, PD tem sido relacionada à exposição a pesticidas 6-8. Aqui nós mostramos em detalhe dois métodos usados em nosso estudo anterior 9. Para analisar os efeitos da rotenona agindo localmente no ENS, nós administrados rotenona usando uma sonda de um ano de idade C57/BL6 camundongos. Rotenona é um pesticida amplamente utilizado que inibe fortemente Complexo mitocondrial I 10. É altamente lipofílica e mal absorvido no trato gastrointestinal 11. Nossos resultados mostraram que a administração de 5 mg / kg de rotenona não inibiu o complexo I mitocondrial atividade no músculo ou no cérebro. Assim, o que sugere que isso usar nosso rotenona método de administração não atravessar o sistema hepatoportal e estava atuando apenas na ENS. Aqui nós mostramos um método para administrar pesticidas usando uma sonda e do protocolo de análise de imagem utilizada para analisar os efeitos do pesticida em alfa-sinucleína acumulação na ENS. A primeira parte mostra um método que permite a administração intragástrica de pesticidas (rotenona) a uma concentração desejada preciso. O segundo método apresenta uma semi-automática de protocolo de análise de imagem para analisar acumulação de alfa-sinucleína na ENS usando um software de análise de imagem.
Protocol
1) Administração Intragástrico de rotenona
- Pesar o animal.
- Calcular o volume total de rotenona / veículo solução necessária. Neste caso 0,01 ml por grama do peso do animal.
- Cobrar uma seringa de 1 mL com o volume calculado anteriormente de solução de rotenona (0,625 rotenona mg / mL, carboximetilcelulose 4% e 1,25% clorofórmio) ou solução veículo (carboximetilcelulose 4% e 1,25% clorofórmio). Neste caso, corresponde a uma dose rotenona 5 mg / kg.
- Pegue o mouse e, segurando o rabo do rato com uma mão, esticar a pele do pescoço, puxando-a com os dois primeiros dedos da outra mão.
- Uma vez que a cabeça é fixa entre os dois dedos, magra contra a palma da mão e transformá-lo de cabeça para baixo. Fixar a cauda usando o quarto e quinto dedos.
- Mantendo a cabeça para trás, pressione o palato a se abrirem a boca do rato. Suavemente introduzir a sonda na boca. É importante usar uma agulha gavagem e não uma agulha regular. Lentamente, mova o gavage na direção do estômago longe o suficiente. Isso irá evitar o material ficar nos pulmões.
- Administrar a solução rotenona ou veículo pressionando suavemente o êmbolo. Quando concluído, lentamente extrair o gavage.
- Coloque o animal em volta outra gaiola até que todos os animais de uma gaiola é feito.
2) Procedimentos imunocoloração
- Após o tratamento, os ratos são anestesiados com cetamina 100 mg / kg ip und Xylasina 10 mg / kg e intracardially perfundidos com paraformaldeído 4% em PBS.
- A coragem são, então, extraídos por dissecção, e colocados em sacarose 15% durante a noite. No dia seguinte, o tecido é transferido para 30% de sacarose e incubadas novamente durante a noite a 4 ° C.
- O tecido é então colocado em Tissue-tek e armazenados em um freezer -80 ° C até o uso.
- Utilizando um criostato, 20 micron intestino seções transversais são transferidos para slides Superfrost.
- Bloqueio e imunocoloração procedimentos usando anticorpos anti-tubulina βIII e anti-alfa-sinucleína são então realizados como descrito anteriormente 9.
3) Análise de Imagem alfa-sinucleína Inclusão
Recomenda-se que uma pessoa externa inconscientes de origem images 'executa a análise. Portanto, os dados deve ser codificada. Análise de imagens foi realizada utilizando software FIJI.
- Abra o arquivo de imagem confocal. Então, dividir os canais de modo que é possível trabalhar em cada canal independentemente.
- Feche os canais que não vai ser usado e selecione Análise> Definir Escala e definir o tamanho do pixel a 1. Definir a distância conhecida a 0,13 (isso vai depender do objetivo e da resolução utilizada) e clique em global. O tamanho da imagem será mostrada em microns.
- Selecione alfa-sinucleína canal e selecione gânglio, certifique-se que a seleção inclui o gânglio em todas as fatias.
- Image Press> Duplicar para duplicar a imagem. Com o gânglio selecionado, apenas uma imagem do tamanho do gânglio será duplicada.
- Prima Editar> Limpar Fora. A parte da imagem fora da região selecionada se tornará preto.
- Duplique a imagem novamente para determinar em etapas posteriores quão bem o procedimento foi. Imagens que tenham um sinal de alta relação ao ruído de fundo não deve ser usado para análise de imagem.
- Selecione Image> Adjust> Limiar e selecione MaxEntropy. Em seguida, passar as fatias na imagem cortada e original para garantir que o processo correu bem. O limite entrópico seleciona um nível de intensidade de sinal baseado no histograma da imagem e somente aqueles pixels com intensidades superiores a este limite será exibido em uma imagem branca sobre preto.
- Selecione Processar, em seguida, clique em Smooth. Esta etapa transforma as bordas pixeled das imagens em bordas lisas.
- Selecione Processar, em seguida, clique em binário, e escolha a opção Make Binary. A imagem será exibida como um negro sobre a imagem branca.
- Duplicate imagem para realizar o próximo passo na imagem duplicada.
- Clique em Analisar> Analisar partículas. Em seguida, selecione Show: Esboços e clique em Resumir. O resto das configurações deve ser em folhas padrão. Esta função reconhece o número total de pixels com um sinal e aqueles que são agrupados. A superfície total de pixels com sinal mais o número de grupos de pixels eo tamanho médio são relatados.
- Comparar e selecionar a maior fatia que se ajusta bem. A fatia será marcada.
- Cópia da tabela de dados com a superfície alfa-sinucleína total, o número de inclusões e do tamanho médio de partícula. Colar os dados em uma planilha excel ou anotado em outro lugar.
- Retornar para FIJI e encontrar a fatia selecionada anteriormente no canal β-tubulina, e selecioná-lo.
- Selecione área de gânglio e clique em Analisar em seguida, selecione Medida. Outra tabela é exibida com osuperfície total do gânglio.
- Extrair os dados da tabela para a folha de excel perto da medição alfa-sinucleína ou copiá-lo para baixo em outro lugar.
- Usando excel, divide os diferentes parâmetros obtidos na medição alfa-sinucleína pela superfície gânglio para obter total de alfa-sinucleína número superfície e inclusão normalizado pelo tamanho do gânglio.
4) Resultados Representante
Quando o protocolo de administração gavage é realizado corretamente os inconvenientes para o animal são mínimas. Tratamento com esta concentração de rotenona permite um efeito local da rotenona na ENS, sem níveis de rotenona em sangue e sem inibição dos músculos e cérebro complexo mitocondrial que, mesmo após 1,5 meses de tratamento (ver Figura 1). Se a análise de imagem é realizado corretamente uma análise rigorosa da alfa-sinucleína padrão deve ser possível. Dá dados confiáveis sobre a quantidade total de alfa-sinucleína (superfície total), alfa-sinucleína padrão no celular (número de inclusões) ea presença de alfa-sinucleína inclusões (tamanho inclusão) (Figura 2).
Figura 1. Disfunção motora em camundongos tratados com rotenona sem detecção de rotenona no sangue ou no CNS. Um padrão, (50 ng / mL) e cromatograma a partir de amostras do cérebro de 20, 10 e 5 mg / kg camundongos tratados. B e C, quantificação dos níveis de rotenona no sangue (B) e sistema nervoso central (C). B, os níveis sanguíneos 1 , 2 e 3 horas após o tratamento. Camundongos foram divididos em três grupos (n = 3) e tratados com 2,5, 5, 10 e 20 mg / kg rotenona (n = 3), 300 mL de sangue foi extraído horas 1, 2 e 3 após a administração de rotenona e agrupados para HPLC análise. C, os ratos foram tratados durante uma semana uma vez por dia com 5 (n = 3), 10 (n = 3) e 20 (n = 1) mg / kg rotenona cérebro e tronco cerebral foram extraídos 1 e 2 horas depois última administração e preparados para análise por HPLC. D, Complexo I mitocondrial atividade muscular e cerebral amostras de 1,5 meses camundongos tratados.
Figura 2. Rotenona administrado localmente induz fosforilação alfa-sinucleína, acumulação e agregação com gliose nos gânglios ENS. (Barras de escala de 20 mm). A, B, C, anti-tubulina βIII, alfa-sinucleína ea coloração DAPI no duodeno (B) e íleo ( A, C) seções. Seta na B, 1,5 meses de tratamento induziu um padrão de aumento da alfa-sinucleína punctate dentro gânglios do sistema nervoso entérico, quando comparado a 3 meses controles (A). Seta no C, 3 meses de tratamento formação induzida de maior alfa-sinucleína inclusões (ø> 6 mm). D, imunofluorescência usando anti-alfa-sinucleína, Thioflavine S e DAPI. Seta no D, apenas três meses camundongos tratados mostraram maior agregação desses alfa-sinucleína acumulações. E, E ', E'', imagem passos análise e quantificação. E, exemplo de imagem usada na quantificação mostrando um gânglio ENS imunocoradas contra alfa-sinucleína mostrando inclusões diferentes. E ', exemplo de imagem obtida após o protocolo de análise de imagem. E'', sobreposição entre algumas das inclusões original (verde) e da representação obtida após a realização do protocolo (linhas amarelas). FG, a quantificação do experimento mostrado na AC foi feito usando a segmentação automática e métodos baseados em entropia thresholding. Um único asterisco, F P <0,05, e dê um duplo asterisco, P <0,01., Cada coluna representa total de alfa-sinucleína superfície superfície / ganglionares. G, cada coluna representa o número total de alfa-sinucleína inclusões / superfície ganglionares. Todos os gráficos mostram média ± EPM
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Discussion
Administração intragástrica foi previamente realizado 12. No entanto, segundo manuscrito Inden, a rotenona foi administrada de sal dissolvido em 0,5% de carboximetilcelulose de sódio (CMSS) sozinho. Rotenona é uma substância de alto liphophylic. Portanto, rotenona não pode ser dissolvido em CMSS 0,5% sozinho e se irá precipitar feito. O uso de clorofórmio cria uma suspensão rotenona distribuída uniformemente evitando a precipitação. Além disso, devido às concentrações mais elevadas do pesticida no CMSS, o volume final da solução administrada é também diminuiu significativamente. Assim, redução de complicações na administração.
Recomendamos o uso de gavages reta. O esôfago do rato é reta, terminando diretamente em um lado do estômago. Portanto, gavages retas são mais adequados para esta tarefa.
Análise de imagem confocal de imagens foi feita usando software FIJI. Os plug-ins para este software pode ser baixado online. A coloração de imunofluorescência para análise de imagens foi realizada como descrito anteriormente 9. Imagens foram adquiridas utilizando um microscópio Zeiss LSM 510 Confocal. É importante que as imagens são adquiridas usando a relação sinal / ruído mesmo. Isto pode ser conseguido ajustando o ganho e offset antes da aquisição.
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Disclosures
Francisco Pan-Montojo tem um pedido de patente pendente para este modelo animal (número de aplicativos PCT / PE 2009/005688).
Acknowledgments
O Pedro Barrie de la Maza Fundação apoiaram este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Germany |
| Chloroform | Carl Roth GmbH | 3313.1 | Germany |
| Carboxymethylcellulose | Sigma-Aldrich | C5678 | Germany |
| Gavage 1,2 mm x 60 mm | Unimed | Switzerland | |
| LSM 510 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| FIJI | http://pacific.mpi-cbg.de |
References
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