Summary
파킨슨병은 살충제에 대한 노출과 관련된되었습니다. 여기서 우리는 원하는 농도와 장용 신경계의 알파 synuclein의 축적에서 효과를 분석하는 방법에 위장 튜브를 사용하는 살충제를 전달하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
파킨슨병 (PD) 환자에서 연관된 병리 인터 알리아 장용 신경계 (팔) 1,2, 후각 망울 (OB), 미주 (DMV) 3 등의 모터 핵, intermediolateral 관련된 특성 패턴을 따릅니다 척수 4와 substantia 니그라의 핵, 4,5 질병의 neuropathological 준비를위한 기초를 제공합니다. 팔과 OB가 가장 노출된 신경 구조와 영향을 가장 먼저 사람입니다. 흥미롭게도, PD는 농약 노출 6-8 관련된되었습니다. 여기 세부에서 우리의 이전 연구 9에 사용되는 두 가지 방법을 보여줍니다. 팔에서 로컬로 연기 rotenone의 효과를 분석하기 위해, 우리는 한 세 C57/BL6 마우스로 gavage를 사용하여 rotenone을 관리. Rotenone 강력 mitochondrial 복잡한에게 I 10을 억제 널리 사용되는 살충제이다. 그것은 매우 lipophylic과 저조한 위장관 11 흡수됩니다. 우리의 결과는 5 MG / rotenone의 kg의 행정부가 mitochondrial 복잡한 I 근육이나 두뇌의 활동을 억제하지 않았 것으로 나타났다. 따라서, 우리의 관리 방법 rotenone을 사용하면 hepatoportal 시스템을 교차하지 않았고 오직 팔에 행동 것을 제안. 여기서 우리는 엔터 프라이즈 네트워크에 알파 synuclein의 축적에 살충제의 효과를 분석하는 데 사용하는 gavage 및 이미지 분석 프로토콜을 사용하여 살충제를 관리하는 방법을 보여줍니다. 첫 번째 부분은 원하는 정확한 농도의 살충제 (rotenone)의 intragastric 관리를 허용하는 방법을 보여줍니다. 두 번째 방법은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 엔터 프라이즈 네트워크에 알파 synuclein의 축적을 분석 반자동 이미지 분석 프로토콜을 보여줍니다.
Protocol
Rotenone 1) Intragastric 관리
- 동물의 무게를.
- 필요한 rotenone / 자동차 솔루션의 전체 볼륨을 계산합니다. 동물 중량 g 당 이러한 경우에는 0.01 ML.
- 이전에 계산 rotenone 솔루션의 볼륨 (0.625 MG / ML rotenone, 4 % carboxymethylcellulose 및 1.25 %의 클로로포름) 또는 차량 용액 (4 % carboxymethylcellulose 및 1.25 %의 클로로포름)와 1 ML의 주사기를 부과합니다. 이 경우는 5 MG / kg rotenone 선량에 해당합니다.
- 마우스를 들고, 한 손으로 마우스의 꼬리를 들고, 다른 한편의 첫 번째와 두 번째 손가락으로 당겨 목 피부를 스트레칭.
- 머리가 두 손가락 사이에 고정되면, 손바닥에 대해 그것을 엎드려서 거꾸로 그것을 켜십시오. 네 번째와 다섯째 손가락을 사용하여 꼬리를 수정.
- 뒤로 향해 머리를 유지, 마우스의 입을 열 미각을 누르십시오. 부드럽게 입안에 gavage을 소개합니다. gavage 바늘이 아닌 일반 바늘을 사용하는 것이 중요합니다. 천천히, 멀리 위 방향으로 gavage 이동합니다. 이것은 폐에 받고 자료를 막을 수있을 겁니다.
- 부드럽게 색전증을 눌러 rotenone 솔루션이나 차량을 관리할 수 있습니다. 완료되면, 천천히 gavage 압축을 풉니다.
- 한 케이지에서 모든 동물이 완료되기 전까지 다른 새장에있는 동물을 돌려 놓습니다.
2) Immunostaining 절차
- 치료 후, 마우스는 Ketamin 100 MG / kg 놀이 Xylazin 10 MG / kg IP 및 intracardially PBS의 4 % Paraformaldehyde로 perfused를 사용하여 anesthetized 있습니다.
- 배짱은 다음 절개로 추출하고, 야간 15 % 자당에 배치됩니다. 그 다음날은, 조직은 30 % 자당에 전송하고 4 박 다시 incubated 있습니다 ° C.
- 조직은 다음 조직 테크에 위치하고 사용할 때까지 -80 ° C의 냉동고에 저장됩니다.
- 그라 이오 스탯을 사용하여 20 마이크론 소장 교차 섹션은 Superfrost 슬라이드로 전송됩니다.
- 안티 βIII - tubulin 및 안티 알파 synuclein 항체를 사용하여 프로 시저를 차단하고 immunostaining 것은 다음 앞에서 설명한 9로 수행됩니다.
3) 알파 synuclein의 포함 이미지 분석
그것은 이미지가 '원산지 모르고 외부 사람이 분석을 수행하는 것이 좋습니다. 따라서, 데이터는 codified해야합니다. 이미지 분석 피지 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.
- 공촛점 이미지 파일을 엽니다. 그것이 개별적으로 각 채널에서 작동이 가능합니다 그래서 그 다음, 채널을 분할.
- 사용하고 Analyse> 규모를 설정하고 1 픽셀 크기를 설정을 선택하지 않을 이들 채널을 닫습니다. 0.13 (이것은 객관적이고 사용되는 해상도에 따라 달라집니다)로 알려진 거리를 설정하고 세계 클릭하십시오. 이미지의 크기는 현재 미크론으로 표시됩니다.
- 알파 synuclein 채널을 선택하고 신경절을 선택, 선택이 모든 조각에 신경을 encloses 있는지 확인하십시오.
- 보도 자료 이미지> 이미지를 복제하는 중복. 신경절을 선택한 단지 이미지는 신경절의 크기가 중복됩니다.
- 보도 편집> 지우기 밖에. 선택 영역 밖으로 이미지의 부분은 검정색이 될 것입니다.
- 프로 시저 간 얼마나 잘 나중 단계에서 확인하기 위해 이미지를 다시 복사. 배경 노이즈 비율에 높은 신호를 가지고 이미지는 이미지 분석을 위해 사용하지 않아야합니다.
- 이미지> 조정> 임계값을 선택하고 다음 MaxEntropy 선택합니다. 그런 다음 프로 시저가 잘 된 것을 보장하기 위해 자른 이미지와 원래의 하나의 슬라이스를 통해 이동합니다. entropic 임계값은 이미지의 히스토그램이 임계값 이상의 농도가 검정색 이미지 위에 흰색에 표시됩니다에서만 해당 픽셀에 따라 강도 신호 레벨을 선택합니다.
- 프로세스를 선택한 다음, 부드러운 클릭하십시오. 이 단계는 매끄러운 가장자리에있는 이미지의 pixeled 가장자리를 변환합니다.
- 프로세스를 선택한 다음 바이너리를 클릭하고, 바이너리를 만들기를 선택합니다. 이미지가 이미지 위에 흰색 검정색으로 표시됩니다.
- 중복 이미지 다음 단계를 수행하는 이미지를 중복.
- 분석> 분석 입자를 클릭하십시오. 그런 다음 표시를 선택 : 개요하고 요약을 클릭합니다. 설정의 나머지 부분은 기본에 잎이 달린해야합니다. 이 함수는 신호와 함께 그룹화하는 기능과 픽셀의 총 개수를 인식합니다. 신호 플러스 픽셀 그룹의 수와 평균 크기가 픽셀의 전체 표면은보고됩니다.
- 잘 조정 가장 큰 조각을 비교하고 선택합니다. 슬라이스가 표시됩니다.
- 총 알파 synuclein 표면, 흠도의 수와 평균 입자 크기의 데이터 테이블을 복사합니다. Excel 스프레드 시트 또는 다른 주석에 데이터를 붙여 넣습니다.
- 피지 (으)로 돌아가기와 β - tubulin 채널에서 이전에 선택한 슬라이스를 찾아, 그것을 선택합니다.
- 신경절 영역을 선택하고을 클릭 다음 측정을 선택 분석. 또 다른 테이블을 보여주는가 나타납니다신경절 총 표면.
- 알파 synuclein 측정 근처 엑셀 시트로 테이블에서 데이터를 추출하거나 다른 곳에서 내려 복사합니다.
- 엑셀 사용 신경절의 크기로 정규화 총 알파 synuclein의 표면 및 포함 번호를 얻으려면 신경절 표면으로 알파 synuclein 측정에서 얻은 여러 가지 매개 변수를 나눕니다.
4) 대표 결과
gavage 관리 프로토콜이 올바르게 수행하면 동물에 대한 불편을 최소화하고 있습니다. rotenone의 농도를 사용하는 치료는 혈액에 rotenone 수준없이 팔에 rotenone의 로컬 효과를 가능하게하고 근육이나 뇌 mitochondrial 콤플렉스없이 억제 나 역시 치료의 1.5 개월 (그림 1 참조) 후. 이미지 분석이 올바르게 수행하는 경우 알파 synuclein 패턴의 엄격한 분석이 가능하여야한다. 그것은 알파 - synuclein (총 표면), 알파 - synuclein의 셀에 패턴 (흠도의 수)와 알파 synuclein의 흠도의 존재 (포함 크기) (그림 2)의 총액에 대한 신뢰할 수있는 데이터를 제공합니다.
그림 1. rotenone의 모터 장애는 혈액이나 CNS에 rotenone의 검출없이 쥐를 치료. 표준 (50 NG / ML) 20 10 5 MG / kg 취급 생쥐의 두뇌 샘플에서 크로마토 그램. B와 C, rotenone 혈액의 수준 (B) 및 CNS (C)의 양을 정함. B, 혈액 레벨 1 , 치료 후 2, 3 시간. 마우스가 세 그룹 (N = 3)에 나누어 2.5, 5, 10 및 20 MG / kg rotenone 취급했다 (N = 3), 혈액 300 μL는 rotenone 관리 후 1, 2, 3 시간 추출하여 함께 풀링되었습니다 5 (N = 3), 10 (N = 3) 및 20과 함께 하루 (N = 1) MG / kg rotenone, 두뇌 및 brainstem가 2 시간 후에 1을 추출하고 있었다 한번 HPLC 분석. C는 생쥐 한 주 동안 치료를했다 마지막으로 관리 및 HPLC 분석. D, mitochondrial 콤플렉스 I 1.5 개월 치료를 생쥐의 근육과 두뇌 샘플의 활동 준비에 들어갔다.
그림 2. 로컬로 관리되는 rotenone은 팔의 신경에 gliosis와 알파 synuclein의 인산화, 축적 및 집계를 유도. (스케일 바 20 μm의). A, B, C, 안티 βIII - tubulin, 알파 synuclein과 십이지장에서 DAPI의 얼룩 (B)과 회장 (이 A, C) 부분. 3 개월 제어 (A)에 비해 B의 화살표는, 1.5 개월 치료 장용 신경계의 신경 내부 증가 알파 synuclein 작은 반점이있는 패턴을 유도. C에서 화살표, 큰 알파 synuclein의 함유 (ø> 6 μm의)의 3 개월 치료를 유발 형성. D, 안티 - 알파 - synuclein, Thioflavine S 및 DAPI를 사용하여 immunofluorescence 염색법. D에 화살표, 오직 삼개월 취급 쥐가이 큰 알파 synuclein의 축적의 집합을 보여주었다. E, E ', E', 이미지 분석 부량 단계. E, 팔의 신경절을 보여주 부량에 사용되는 이미지의 예를 보여주는 알파 synuclein에 대한 immunostained 다른 흠도. E ', 이미지 분석 프로토콜 후 얻은 이미지의 예. E', 원래 흠도 (녹색)와 프로토콜 (노란색 선)을 수행한 후 얻은 표현의 일부 사이에 중복됩니다. FG에 표시된 실험 부량 AC는 자동으로 세분화 및 엔트로피 기반 thresholding 방법을 사용하여 만들어졌다. 단일 별표, P <0.05, 두 번 별표, P <0.01. F, 각 열의 총 알파 synuclein의 표면 / 신경절 표면을 나타냅니다. G, 각 컬럼은 알파 synuclein의 함유 / 신경절 표면의 총 수를 나타냅니다. 모든 그래프는 ± SEM을 의미 표시
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Discussion
Intragastric 관리는 이전에 12을 수행하고 있습니다. 그러나, 0.5 % carboxymethylcellulose 나트륨 소금 (CMSS) 혼자 인덴의 원고에 따르면, rotenone가 실시되었다 해산. Rotenone는 높은 liphophylic 물질입니다. 따라서, rotenone 혼자 0.5 % CMSS에 녹아 수 없습니다 그래서 할 경우에는 침전됩니다. 클로로포름의 사용은 강수량을 피한 균등하게 분산 rotenone 서스펜션을 만듭니다. 또한, CMSS에서 살충제의 높은 농도로 인해, 관리 솔루션의 최종 볼륨도 크게 감소합니다. 따라서 행정의 합병증을 감소.
우리는 곧장 gavages의 사용을 권장합니다. 마우스의 식도는 직접 복부의 한쪽 끝, 직선이다. 따라서, 직선 gavages이 작업을 위해 더 적합합니다.
공촛점 이미지의 이미지 분석 피지 소프트웨어를 사용하여 이루어졌다. 본 소프트웨어에 대한 플러그인을 온라인으로 다운로드받을 수 있습니다. 이미지 분석을위한 immunofluorescent 얼룩은 앞에서 설명한 9로 수행되었다. 이미지는 LSM 510 자이스 혈구 공촛점 현미경을 사용하여 인수했다. 이미지가 같은 신호 / 노이즈 비율을 사용하여 획득하는 것이 중요합니다. 이것은 이득을 조정하여 달성하고 취득하기 전에 오프셋 수 있습니다.
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Disclosures
프란 시스코 판 - Montojo이 동물 모델 (신청 번호 PCT / EP 2009/005688)에 대해 보류중인 특허 출원 있습니다.
Acknowledgments
페드로 드 라 바리 마자 재단은이 작품을지지했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Germany |
| Chloroform | Carl Roth GmbH | 3313.1 | Germany |
| Carboxymethylcellulose | Sigma-Aldrich | C5678 | Germany |
| Gavage 1,2 mm x 60 mm | Unimed | Switzerland | |
| LSM 510 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| FIJI | http://pacific.mpi-cbg.de |
References
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